Bakteriální mikrokompartment - Bacterial microcompartment
Bakteriální mikrokompartmenty ( BMC ) jsou struktury podobné organelám , skládající se z proteinového obalu, který obklopuje enzymy a další proteiny . BMC mají obvykle průměr přibližně 40–200 nanometrů a jsou vyrobeny výhradně z bílkovin. Plášť funguje jako membrána, protože je selektivně propustný. Mezi další kompartmenty na bázi proteinů, které se nacházejí v bakteriích a archeach, patří nanokompartmenty enkapsulinu a plynové vezikuly .
Objev
První BMC byly pozorovány v padesátých letech minulého století na elektronových mikrografech sinic a později byly pojmenovány karboxysomy poté, co byla stanovena jejich role při fixaci uhlíku. Až do 90. let 20. století byly karboxysomy považovány za zvláštnost omezenou na určité autotrofní bakterie. Ale pak genů kódujících proteiny homologní k těm karboxyzom pláště byly identifikovány v PDU (využití propandiol) a zkoušeného zařízení (využití ethanolamin) operonu . Následně transmisní elektronové mikrofotografie buněk Salmonella pěstovaných na propandiolu nebo ethanolaminu ukázaly přítomnost polyedrických těl podobných karboxysomům. Termín metabolosom se používá k označení takových katabolických BMC (na rozdíl od autotrofního karboxysomu).
Ačkoli karboxysom, PDU využívající propandiol (PDU) a ethanolamin (EUT) enkapsulují různé enzymy, a proto mají různé funkce, geny kódující skořápkové proteiny jsou velmi podobné. Většina genů (kódujících skořápkové proteiny a zapouzdřené enzymy) z experimentálně charakterizovaných BMC se nachází blízko sebe v odlišných genetických lokusech nebo operonech. V současné době je sekvenováno více než 20 000 bakteriálních genomů a lze použít bioinformatické metody k nalezení všech genů skořápky BMC a ke zjištění, jaké další geny se nacházejí v okolí, čímž se vytvoří seznam potenciálních BMC. V roce 2014 identifikoval komplexní průzkum 23 různých lokusů kódujících až 10 funkčně odlišných BMC ve 23 bakteriálních kmenech . V roce 2021 bylo při analýze více než 40 000 sekvencí proteinů skořápky ukázáno, že alespoň 45 fylů má členy, které kódují BMC, a počet funkčních typů a podtypů se zvýšil na 68. Role BMC v lidském mikrobiomu je také vyjasnění.
Mušle
Proteinové rodiny tvořící skořápku
BMC skořepina se jeví ikosahedrálně nebo kvazi-ikosahedrálně a je tvořena (pseudo) hexamerními a pentamerními proteinovými podjednotkami. Struktury neporušených obalů byly určeny pro tři funkčně odlišné: typy BMC, karboxysomy, organely GRM2 zapojené do cholinového katabolismu a metabolosom neznámé funkce. Tyto struktury společně ukázaly, že základní principy sestavování skořepin jsou univerzálně zachovány napříč funkčně odlišnými BMC.
Rodina skořepinových proteinů BMC
Hlavními složkami skořápky BMC jsou proteiny obsahující doménu (domény) Pfam00936. Tyto proteiny tvoří oligomery, které mají šestihranný tvar a tvoří fasety skořápky.
Jednodoménové proteiny (BMC-H)
Proteiny BMC-H, které obsahují jedinou kopii domény Pfam00936, jsou nejhojnější složkou faset skořepiny. Byly určeny krystalické struktury řady těchto proteinů, které ukazují, že se skládají do cyklických hexamerů, typicky s malým pórem uprostřed. Tento otvor se navrhuje zapojit do selektivního transportu malých metabolitů přes obal. Většina BMC obsahuje několik odlišných typů proteinů BMC-H (paralogů), které se skládají dohromady a vytvářejí fasety , což pravděpodobně odráží rozsah metabolitů, které musí vstoupit a vystoupit ze skořápky.
Proteiny tandemové domény (BMC-T)
Podskupina skořápkových proteinů se skládá z tandemových (fúzovaných) kopií domény Pfam00936 (proteiny BMC-T), tato evoluční událost byla znovu vytvořena v laboratoři konstrukcí syntetického proteinu BMC-T. Strukturálně charakterizované proteiny BMC-T tvoří trimery, které mají pseudohexamerní tvar. Některé krystalové struktury BMC-T ukazují, že se trimery mohou skládat tváří v tvář. V takových strukturách je jeden pór z jednoho trimeru v „otevřené“ konformaci, zatímco druhý je uzavřený-což naznačuje, že může existovat mechanismus podobný vzduchovému uzávěru, který moduluje propustnost některých skořepin BMC. Zdá se, že toto hradlování je koordinováno po povrchu pláště. Další podskupina proteinů BMC-T obsahuje klastr [4Fe-4S] a může se podílet na transportu elektronů přes obal BMC. Kovová centra byla také zkonstruována do proteinů BMC-T pro vedení elektronů.
Rodina EutN/CcmL (BMC-P)
K zakrytí vrcholů icosahedrální skořepiny je zapotřebí dvanáct pětibokých jednotek. Krystalické struktury proteinů z rodiny EutN/CcmL (Pfam03319) byly vyřešeny a typicky tvoří pentamery (BMC-P). Zdá se, že důležitost proteinů BMC-P při tvorbě skořápky se u různých BMC liší. Ukázalo se, že jsou nezbytné pro tvorbu skořápky PDU BMC, protože mutanty, ve kterých byl odstraněn gen pro protein BMC-P, nemohou vytvářet skořápky, ale ne pro alfa-karboxysom: bez proteinů BMC-P, karboxysomů budou se stále shromažďovat a mnohé jsou prodloužené; tyto mutované karboxysomy se zdají být „děravé“.
Vývoj BMC a vztah k virovým kapsidám
Zatímco BMC skořepina je architektonicky podobná mnoha virovým kapsidům, nebylo zjištěno, že by skořepinové proteiny měly jakoukoli strukturní nebo sekvenční homologii s kapsidovými proteiny. Místo toho strukturální a sekvenční srovnání naznačují, že jak BMC-H (a BMC-T), tak BMC-P se s největší pravděpodobností vyvinuly z bona fide buněčných proteinů, jmenovitě z PII signalizačního proteinu a proteinu obsahujícího OB domény.
Propustnost skořepiny
Je dobře prokázáno, že enzymy jsou zabaleny do obalu BMC a že musí dojít k určitému stupni sekvestrace metabolitu a kofaktoru. Aby však BMC fungovaly, musí být také dovoleno přejít skrz skořápku jiným metabolitům a kofaktorům. Například v karboxysomech musí ribulóza-1,5-bisfosfát, hydrogenuhličitan a fosfoglycerát procházet skořápkou, zatímco difúze oxidu uhličitého a kyslíku je zjevně omezená. Podobně u PDU BMC musí být obal propustný pro propandiol, propanol, propionylfosfát a potenciálně také vitamín B12, ale je zřejmé, že propionaldehyd je nějakým způsobem izolován, aby se zabránilo poškození buněk. Existují určité důkazy, že ATP musí také procházet některými skořápkami BMC.
Bylo navrženo, aby centrální póry vytvořené v hexagonálních proteinových destičkách skořápky byly kanály, kterými metabolity difundují do skořápky. Například póry ve skořápce karboxysomu mají celkově kladný náboj, který byl navržen tak, aby přitahoval negativně nabité substráty, jako je bikarbonát. V mikroprostoru PDU experimenty mutageneze ukázaly, že póry skořápkového proteinu PduA jsou cestou pro vstup propandiolového substrátu. U větších metabolitů je u některých proteinů BMC-T zřejmý hradlovací mechanismus. V mikroprostoru EUT je brána s velkými póry v EutL skořápkovém proteinu regulována přítomností hlavního metabolického substrátu, ethanolaminu.
Přítomnost klastrů železa a síry v některých skořápkových proteinech, pravděpodobně v centrálním póru, vedla k domněnce, že mohou sloužit jako potrubí, kterým mohou být elektrony přenášeny přes plášť.
Typy
Komplexní průzkumy sekvenčních dat mikrobiálního genomu naznačily více než 60 různých metabolických funkcí zapouzdřených skořápkami BMC. Většina se účastní buď fixace uhlíku (karboxysomy), nebo oxidace aldehydu (metabolosomy).
Karboxysomy: fixace uhlíku
Karboxysomy zapouzdřují ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylázu/oxygenázu (RuBisCO) a karboanhydrázu v bakteriích fixujících CO2 jako součást mechanismu koncentrace CO2. Hydrogenuhličitan se čerpá do cytosolu a difunduje do karboxysomu, kde ho karboanhydráza přeměňuje na oxid uhličitý, substrát RuBisCO. Karboxysomová skořápka je považována za jen málo propustnou pro oxid uhličitý, což má za následek účinné zvýšení koncentrace oxidu uhličitého kolem RuBisCO, čímž se zvyšuje fixace CO2. Mutanti, kterým chybí geny kódující karboxysomový obal, vykazují vysoký fenotyp vyžadující CO2 kvůli ztrátě koncentrace oxidu uhličitého, což vede ke zvýšené fixaci kyslíku pomocí RuBisCO. Bylo také navrženo, aby skořápky omezovaly difúzi kyslíku, čímž se zabrání reakci oxygenázy a sníží se nehospodárná fotorespirace.
Metabolosomy: oxidace aldehydu
Kromě anabolických karboxysomů bylo charakterizováno několik katabolických BMC, které se účastní heterotrofního metabolismu prostřednictvím aldehydů s krátkým řetězcem; souhrnně se jim říká metabolosomy.
V roce 2014 bylo navrženo, že navzdory své funkční rozmanitosti má většina metabolosomů společnou zapouzdřenou chemii poháněnou třemi jádrovými enzymy: aldehyddehydrogenázou, alkoholdehydrogenázou a fosfotransacylázou. Protože aldehydy mohou být toxické pro buňky a/nebo těkavé, jsou považovány za sekvestrované v metabolosomu. Aldehyd je zpočátku fixován na koenzym A pomocí NAD+závislé aldehyddehydrogenázy, ale tyto dva kofaktory musí být recyklovány, protože zjevně nemohou procházet skořápkou. Tyto recyklační reakce jsou katalyzovány alkoholdehydrogenázou (NAD+) a fosfotransacetylázou (koenzym A), což vede k fosforylované acylové sloučenině, která může být snadno zdrojem fosforylace na úrovni substrátu nebo vstoupit do centrálního metabolismu, v závislosti na tom, zda organismus roste aerobně nebo anaerobně. Zdá se, že většina, ne -li všechny, metabolosomy využívají tyto základní enzymy. Metabolosomy také zapouzdřují další enzym, který je specifický pro počáteční substrát BMC, který generuje aldehyd; toto je definovaný podpisový enzym BMC.
PDU BMC
Některé bakterie mohou jako zdroj uhlíku používat 1,2-propandiol. Používají BMC k zapouzdření několika enzymů použitých v této cestě (Sampson a Bobik, 2008). PDU BMC je typicky kódován lokusem 21 genů. Tyto geny jsou dostatečné pro sestavení BMC, protože mohou být transplantovány z jednoho typu bakterie do druhého, což vede k funkčnímu metabolosomu u příjemce. Toto je příklad bioinženýrství, které rovněž poskytuje důkazy na podporu hypotézy sobeckých operonů. 1,2-propandiol se dehydratuje na propionaldehyd propandiol dehydratázou, která jako kofaktor vyžaduje vitamín B12. Propionaldehyd způsobuje mutace DNA a v důsledku toho je pro buňky toxický, což pravděpodobně vysvětluje, proč je tato sloučenina izolována v BMC. Konečnými produkty PDU BMC jsou propanol a propionylfosfát, který je poté defosforylován na propionát za vzniku jednoho ATP. Propanol a propionát mohou být použity jako substráty pro růst.
EUT BMC
BMC s využitím etanolaminu (EUT) jsou kódovány v mnoha různých typech bakterií. Ethanolamin se štěpí na amoniak a acetaldehyd působením ethanolamin-amoniak lyázy, která také vyžaduje jako kofaktor vitamín B12. Acetaldehyd je poměrně těkavý a bylo pozorováno, že mutanti s nedostatkem BMC obalu mají růstový defekt a uvolňují přebytečná množství acetaldehydu. Bylo navrženo, že sekvestrace acetaldehydu v metabolosomu brání jeho ztrátě těkavostí. Konečnými produkty EUT BMC jsou ethanol a acetyl-fosfát. Ethanol je pravděpodobně ztraceným zdrojem uhlíku, ale acetyl-fosfát může buď vytvářet ATP, nebo být recyklován na acetyl-CoA a vstupovat do cyklu TCA nebo několika biosyntetických drah.
Bifunkční PDC/EUT BMC
Některé bakterie, zejména ty z rodu Listeria , kódují jediný lokus, ve kterém jsou přítomny geny pro PDC i EUT BMC. Dosud není jasné, zda se skutečně jedná o chimérický BMC se směsí obou sad proteinů, nebo zda se tvoří dva samostatné BMC.
BMC obsahující glycylový radikální enzym (GRM)
Bylo identifikováno několik různých lokusů BMC, které obsahují enzymy glycylových radikálů, které získávají katalytický radikál štěpením s-adenosylkobalaminu. Ukázalo se, že jeden lokus GRM v Clostridium phytofermentans se podílí na fermentaci fukózy a ramnózy, které jsou zpočátku degradovány na 1,2-propandiol za anaerobních podmínek. Glycylový radikální enzym je navržen k dehydrataci propandiolu na propionaldehyd, který je poté zpracován způsobem shodným s kanonickým PDU BMC.
Planctomycetes a Verrucomicrobia BMC (PVM)
Různé linie Planctomycetes a Verrucomicrobia kódují lokus BMC. Bylo prokázáno, že lokus v Planctomyces limnophilus se podílí na aerobní degradaci fukózy a ramnózy. Předpokládá se, že aldoláza generuje laktaldehyd, který se poté zpracovává prostřednictvím BMC, což vede k 1,2-propandiolu a laktylfosfátu.
Rhodococcus a Mycobacterium BMCs (RMM)
U členů rodů Rhodococcus a Mycobacterium byly pozorovány dva typy lokusů BMC , i když jejich skutečná funkce nebyla stanovena. Na základě charakterizované funkce jednoho z genů přítomných v lokusu a předpokládaných funkcí ostatních genů však bylo navrženo, aby tyto lokusy mohly být zapojeny do degradace amino-2-propanolu. Aldehyd generovaný v této predikované dráze bude extrémně toxická sloučenina methylglyoxal; jeho sekvestrace v BMC by mohla buňku chránit.
BMC neznámé funkce (BUF)
Jeden typ lokusu BMC neobsahuje RuBisCO ani žádný z hlavních metabolozomových enzymů a byl navržen k usnadnění třetí kategorie biochemických transformací (tj. Ani fixace uhlíku, ani oxidace aldehydu). Přítomnost genů, u nichž se předpokládá, že kódují amidohydrolázy a deaminázy, by mohla naznačovat, že toto BMC se podílí na metabolismu dusíkatých sloučenin.
Shromáždění
Karboxysomy
Byla identifikována montážní cesta pro beta-karboxysomy a začíná proteinem CcmM nukleačním RuBisCO. CcmM má dvě domény: N-koncovou doménu gama-karboanhydrázy následovanou doménou sestávající ze tří až pěti opakování sekvencí podobných malým podjednotkám RuBisCO. C-koncová doména agreguje RuBisCO, pravděpodobně nahrazením skutečných malých podjednotek RuBisCO v holoenzymu L8-S8, což účinně zesíťuje RuBisCO v buňce do jednoho velkého agregátu, nazývaného prokarboxysom. N-koncová doména CcmM fyzicky interaguje s N-koncovou doménou CcmN proteinu, který zase získává podjednotky hexagonálních skořepinových proteinů prostřednictvím zapouzdřovacího peptidu na svém C-konci. Karboxysomy jsou pak v buňce sinic prostorově zarovnány prostřednictvím interakce s bakteriálním cytoskeletem, čímž je zajištěna jejich stejná distribuce do dceřiných buněk.
Sestava alfa-karboxysomu může být odlišná od sestavy beta-karboxysomů, protože nemají žádné proteiny homologní s CcmN nebo CcmM a žádné zapouzdřovací peptidy. Na elektronových mikrografech byly pozorovány prázdné karboxysomy. Některé mikrofotografie ukazují, že k jejich sestavení dochází jako simultánní srůstání enzymů a skořápkových proteinů, na rozdíl od zdánlivě stupňovitého způsobu pozorovaného u beta-karboxysomů. Ukázalo se, že tvorba jednoduchých alfa-karboxysomů v heterologních systémech vyžaduje pouze velké a malé podjednotky Rubisco, vnitřní kotevní protein CsoS2 a hlavní skořápkový protein CsoS1A.
Fylogenetická analýza skořápkových proteinů obou typů karboxysomů naznačuje, že se nezávisle vyvinuly, každý z metabolozomových předků.
Metabolosomy
Metabolosomová sestava je pravděpodobně podobná sestavě beta-karboxysomu prostřednictvím počáteční agregace proteinů, které mají být zapouzdřeny. Proteiny jádra mnoha metabolosomů se agregují, pokud jsou exprimovány samostatně. Navíc mnoho zapouzdřených proteinů obsahuje koncová prodloužení, která jsou nápadně podobná C-koncovému peptidu CcmN, který rekrutuje skořápkové proteiny. Tyto zapouzdřovací peptidy jsou krátké (asi 18 zbytků) a předpokládá se, že budou tvořit amfipatické alfa-helixy. Bylo ukázáno, že některé z těchto šroubovic zprostředkovávají zapouzdření nativních enzymů do BMC, stejně jako heterologních proteinů (jako je GFP).
Regulace (genetická)
S výjimkou karboxysomů sinic jsou ve všech testovaných případech BMC zakódovány v operonech, které jsou exprimovány pouze v přítomnosti jejich substrátu. Genetické lokusy pro většinu funkčně odlišných typů BMC kódují regulační proteiny, které mohou poskytovat informace o funkci BMC.
PDU BMC v Salmonella enterica jsou indukovány přítomností propandiolu nebo glycerolu za anaerobních podmínek a pouze propandiolu za aerobních podmínek. Tato indukce je zprostředkována globálními regulačními proteiny Crp a ArcA (snímající cyklické AMP a anaerobní podmínky) a regulačním proteinem PocR, který je transkripčním aktivátorem jak pro pdu, tak pro cob lokusy (operon nezbytný pro syntézu vitaminu B12, požadovaný kofaktor pro propandiol dehydratázu).
EUC BMC v Salmonella enterica jsou indukovány prostřednictvím regulačního proteinu EutR současnou přítomností ethanolaminu a vitaminu B12, což se může stát za aerobních nebo anaerobních podmínek. Salmonella enterica může produkovat endogenní vitamín B12 pouze za anaerobních podmínek, i když může dovážet kyanobalamin a přeměňovat ho na vitamín B12 za aerobních nebo anaerobních podmínek.
PVM BMC v Planctomyces limnophilus jsou indukovány přítomností fukosy nebo ramnózy za aerobních podmínek, ale nikoli glukózou. Podobné výsledky byly získány pro GRM BMC od Clostridium phytofermentans , u nichž oba cukry indukují geny kódující BMC, stejně jako ty kódující disimilační enzymy fukózy a ramnózy.
Kromě charakterizovaných regulačních systémů průzkumy bioinformatiky naznačily, že existuje potenciálně mnoho dalších regulačních mechanismů, a to i v rámci funkčního typu BMC (např. PDU), včetně dvoukomponentních regulačních systémů.
Význam pro globální a lidské zdraví
Karboxysomy jsou přítomny ve všech sinicích a mnoha dalších foto- a chemoautotrofních bakteriích. Sinice jsou globálně významnými hybateli fixace uhlíku, a protože k tomu v současných atmosférických podmínkách vyžadují karboxysomy, je karboxysom hlavní součástí globální fixace oxidu uhličitého.
Na virulenci patogenů se podílí několik typů BMC, jako je Salmonella enterica a Listeria monocytogenes . Geny BMC bývají za podmínek virulence upregulovány a jejich mutace vede k defektu virulence, jak bylo posouzeno soutěžními experimenty.
Biotechnologické aplikace
Několik funkcí BMC je činí atraktivními pro biotechnologické aplikace. Protože karboxysomy zvyšují účinnost fixace uhlíku, vynaložilo se mnoho výzkumného úsilí na zavedení karboxysomů a požadovaných transportérů bikarbonátu do rostlinných chloroplastů, aby se s určitým úspěchem vyvinul mechanismus koncentrace chloroplastového CO2. Karboxysomy také poskytují příklad toho, jak znalost cesty montáže BMC umožňuje zjednodušení a snížení počtu nezbytných genových produktů pro stavbu organel. Toto je obzvláště důležité pro zavedení rozdělování do obtížně upravitelných organismů, jako jsou rostliny v rostlinné syntetické biologii. Obecněji řečeno, protože BMC skořepinové proteiny se samy sestavují, mohou být vytvořeny prázdné skořápky, což si vyžádalo snahu navrhnout je tak, aby obsahovaly přizpůsobený náklad. Objev enkapsulačního peptidu na koncích některých proteinů asociovaných s BMC poskytuje způsob, jak začít vytvářet vlastní BMC fúzováním cizích proteinů s tímto peptidem a společnou expresí se skořápkovými proteiny. Například přidáním tohoto peptidu k pyruvát dekarboxyláze a alkoholdehydrogenáze vědci vyvinuli etanolový bioreaktor. Úspěšné byly také strategie pro zapouzdření proteinů do syntetických skořepin pomocí různých domén adaptéru a fúze na konce skořepinových proteinů. Nakonec póry přítomné ve skořápkových proteinech kontrolují propustnost skořápky: tyto mohou být cílem pro bioinženýrství, protože mohou být upraveny tak, aby umožňovaly křížení vybraných substrátů a produktů. Inženýrství propustnosti bylo dokonce rozšířeno i za metabolity; póry skořepinového proteinu byly upraveny tak, aby vedly elektrony.
Kromě potenciálu pro rozdělování metabolismu v bioinženýrství mají syntetické BMC mnoho potenciálních aplikací jako nanoterapeutika. Další technické pokroky, jako je schopnost konstruovat skořápky in vitro, rychle umožňují vývoj BMC v biotechnologiích.