Chemická biologie - Chemical biology

Chemická biologie je vědní obor zahrnující oblasti chemie a biologie . Disciplína zahrnuje aplikaci chemických technik, analýz a často malých molekul produkovaných syntetickou chemií ke studiu a manipulaci s biologickými systémy. Na rozdíl od biochemie , která zahrnuje studium chemie biomolekul a regulaci biochemických drah v buňkách a mezi nimi, se chemická biologie zabývá chemií aplikovanou na biologii (syntéza biomolekul, simulace biologických systémů atd.).

Úvod

Některé formy chemické biologie se pokoušejí odpovědět na biologické otázky studiem biologických systémů na chemické úrovni. Na rozdíl od výzkumu využívajícího biochemii , genetiku nebo molekulární biologii , kde mutageneze může poskytnout novou verzi požadovaného organismu, buňky nebo biomolekuly, zkoumá systémy chemické biologie systémy in vitro a in vivo s malými molekulami , které byly navrženy pro konkrétní nebo identifikované na základě biochemického nebo buněčného screeningu (viz chemická genetika ).

Chemická biologie je jednou z několika interdisciplinárních věd, které se obvykle liší od starších, redukcionistických oborů a jejichž cílem je dosáhnout popisu vědeckého holismu . Chemická biologie má vědecké, historické a filozofické kořeny v lékařské chemii , supramolekulární chemii , bioorganické chemii , farmakologii , genetice , biochemii a metabolickém inženýrství .

Zajímavé systémy

Obohacovací techniky pro proteomiku

Chemičtí biologové pracují na zlepšení proteomiky prostřednictvím vývoje strategií obohacování, chemických afinitních značek a nových sond. Vzorky pro proteomiku často obsahují mnoho peptidových sekvencí a sledovaná sekvence může být vysoce zastoupena nebo má nízkou četnost, což vytváří bariéru pro jejich detekci. Metody chemické biologie mohou snížit složitost vzorku selektivním obohacením pomocí afinitní chromatografie . To zahrnuje cílení peptidu s rozlišovacím znakem, jako je biotinový štítek nebo posttranslační modifikace . Byly vyvinuty metody, které zahrnují použití protilátek, lektinů k zachycení glykoproteinů a imobilizovaných kovových iontů k zachycení fosforylovaných peptidů a enzymových substrátů k zachycení vybraných enzymů.

Enzymové sondy

Aby se zkoumala enzymatická aktivita na rozdíl od celkového proteinu, byla vyvinuta činidla na základě aktivity, která značí enzymaticky aktivní formu proteinů (viz proteomika založená na aktivitě ). Inhibitory serinové hydrolázy a cysteinové proteázy byly například převedeny na sebevražedné inhibitory . Tato strategie zvyšuje schopnost selektivně analyzovat složky s nízkým výskytem prostřednictvím přímého cílení. Aktivitu enzymu lze také monitorovat prostřednictvím převedeného substrátu. Identifikace substrátů enzymu je problémem značných obtíží v proteomice a je zásadní pro pochopení drah přenosu signálu v buňkách. Metoda, která byla vyvinuta, používá "analogově citlivé" kinázy ke značení substrátů pomocí nepřirozeného analogu ATP, což usnadňuje vizualizaci a identifikaci pomocí jedinečné rukojeti.

Glycobiologie

Zatímco DNA , RNA a proteiny jsou kódovány na genetické úrovni, glykany (cukerné polymery) nejsou kódovány přímo z genomu a pro jejich studium je k dispozici méně nástrojů. Glycobiologie je tedy oblastí aktivního výzkumu pro chemické biology. Buňky mohou být například zásobeny syntetickými variantami přírodních cukrů, aby se prozkoumala jejich funkce. Výzkumná skupina Carolyn Bertozzi vyvinula metody pro místně specifickou reakci molekul na povrchu buněk pomocí syntetických cukrů.

Kombinatorická chemie

Chemičtí biologové použili automatizovanou syntézu různých knihoven malých molekul, aby provedli vysoce výkonnou analýzu biologických procesů. Takové experimenty mohou vést k objevu malých molekul s antibiotickými nebo chemoterapeutickými vlastnostmi. Tyto kombinatorické chemické přístupy jsou totožné s přístupy používanými v oboru farmakologie.

Zaměstnávání biologie

Mnoho výzkumných programů se také zaměřuje na využívání přírodních biomolekul k plnění biologických úkolů nebo na podporu nové chemické metody. V tomto ohledu výzkumníci z chemické biologie ukázali, že DNA může sloužit jako šablona pro syntetickou chemii, samo-skládající se proteiny mohou sloužit jako strukturální lešení pro nové materiály a RNA může být vyvíjena in vitro za vzniku nové katalytické funkce. Navíc heterobifunkční (oboustranné) syntetické malé molekuly, jako jsou dimerizéry nebo PROTAC, přinášejí dva proteiny dohromady uvnitř buněk, které mohou synteticky indukovat důležité nové biologické funkce, jako je cílená degradace proteinů.

Syntéza peptidů

Chemická syntéza proteinů je cenným nástrojem v chemické biologii, protože umožňuje zavádění nepřirozených aminokyselin a také zabudování „ posttranslačních modifikací “ specifických pro zbytek, jako je fosforylace, glykosylace, acetylace a dokonce ubikvitinace . Tyto schopnosti jsou cenné pro chemické biology, protože k sondování a změně funkčnosti proteinů lze použít nepřirozené aminokyseliny, zatímco je známo, že posttranslační modifikace regulují strukturu a aktivitu proteinů. Ačkoli byly k dosažení těchto cílů vyvinuty přísně biologické techniky, chemická syntéza peptidů má často nižší technickou a praktickou bariéru pro získání malého množství požadovaného proteinu.

Aby se pomocí malých fragmentů peptidů vyrobených syntézou vytvořily polypeptidové řetězce o velikosti proteinu, používají chemičtí biologové proces nativní chemické ligace . Nativní chemická ligace zahrnuje kopulaci C-koncového thioesteru a N-koncového cysteinového zbytku, což nakonec vede k vytvoření „nativní“ amidové vazby. Jiné strategie, které byly použity pro ligaci peptidových fragmentů pomocí acylové přenosové chemie poprvé zavedené s nativní chemickou ligací, zahrnují ligaci exprimovaného proteinu, techniky sírování/odsiřování a použití odstranitelných thiolových pomocných látek. Exprimovaná ligace proteinu umožňuje biotechnologickou instalaci C-koncového thioesteru za použití inteinů , což umožňuje připojení syntetického N-koncového peptidu k rekombinantně produkované C-koncové části. Jak techniky sírování/odsiřování, tak použití odnímatelných thiolových pomocných látek zahrnují instalaci syntetické thiolové skupiny k provádění standardní chemie přirozené chemické ligace, následovanou odstraněním pomocné látky/thiolu.

Řízená evoluce

Primárním cílem proteinového inženýrství je návrh nových peptidů nebo proteinů s požadovanou strukturou a chemickou aktivitou. Protože naše znalosti o vztahu mezi primární sekvencí, strukturou a funkcí proteinů jsou omezené, je racionální návrh nových proteinů s upravenými aktivitami extrémně náročný. V řízené evoluci lze k napodobení přirozeného výběru v laboratoři použít opakované cykly genetické diverzifikace následované screeningem nebo selekčním procesem k návrhu nových proteinů s požadovanou aktivitou.

Existuje několik metod pro vytváření velkých knihoven sekvenčních variant. Mezi nejpoužívanější jsou podrobí DNA na UV záření , nebo chemickým mutagenům , PCR náchylné k chybám , degenerovaných kodonů nebo rekombinací . Jakmile je vytvořena velká knihovna variant, jsou k nalezení mutantů s požadovaným atributem použity selekční nebo screeningové techniky. Mezi běžné selekční/screeningové techniky patří FACS , mRNA displej , fágový displej a rozdělování in vitro . Jakmile jsou nalezeny užitečné varianty, jejich sekvence DNA je amplifikována a podrobena dalším kolům diverzifikace a selekce.

Vývoj zaměřených metod evoluce byl oceněn v roce 2018 s udělením Nobelovy ceny za chemii na Frances Arnold evoluce enzymů a George Smith a Gregory zimě pro fágový displej.

Bioorthogonální reakce

Úspěšné značení požadované molekuly vyžaduje specifickou funkcionalizaci této molekuly, aby chemospecificky reagovala s optickou sondou. Aby byl experiment s označováním považován za robustní, musí tato funkcionalizace minimálně narušit systém. Bohužel tyto požadavky je často obtížné splnit. Mnoho reakcí běžně dostupných organickým chemikům v laboratoři není v živých systémech k dispozici. Reakce citlivé na vodu a redox by neprobíhaly, činidla náchylná k nukleofilnímu útoku by nenabízela žádnou chemospecificitu a žádné reakce s velkými kinetickými bariérami by nenašly dostatek energie v relativně nízkoteplotním prostředí živé buňky. Chemici tedy nedávno vyvinuli panel bioorthogonální chemie, který probíhá chemospecificky, navzdory prostředí, které rušilo reaktivní materiály in vivo .

Ke spojení sondy s požadovanou molekulou musí dojít v přiměřeně krátkém časovém rámci; kinetika kopulační reakce by proto měla být velmi příznivá. Chemie kliknutí je vhodná k vyplnění tohoto výklenku, protože reakce na klikání jsou rychlé, spontánní, selektivní a vysoce výnosné. Bohužel nejslavnější „klikací reakce“, cykloadice [3+2] mezi azidem a acyklickým alkynem , je katalyzována mědí, což představuje vážný problém pro použití in vivo kvůli toxicitě mědi. Aby se obešla nutnost použití katalyzátoru, laboratoř Carolyn R. Bertozzi zavedla inherentní kmen do alkinu pomocí cyklického alkynu. Zejména cyklooktyn reaguje s azidovými molekulami s výraznou silou.

Nejběžnějším způsobem instalace bioorthogonální reaktivity do cílové biomolekuly je metabolické značení. Buňky jsou ponořeny do média, kde je přístup k živinám omezen na synteticky modifikované analogy standardních paliv, jako jsou cukry. V důsledku toho jsou tyto změněné biomolekuly začleněny do buněk stejným způsobem jako nemodifikované metabolity. Do systému je poté začleněna sonda, která zobrazuje osud změněných biomolekul. Jiné způsoby funkcionalizace zahrnují enzymatické vložení azidů do proteinů a syntézu fosfolipidů konjugovaných s cyklooktyny.

Objev biomolekul pomocí metagenomiky

Pokroky v moderních sekvenčních technologiích na konci 90. let 20. století umožnily vědcům zkoumat DNA společenstev organismů v jejich přirozeném prostředí („eDNA“), aniž by se jednotlivé druhy kultivovaly v laboratoři. Tento metagenomický přístup umožnil vědcům studovat široký výběr organismů, které dříve nebyly charakterizovány částečně kvůli nekompetentním podmínkám růstu. Mezi zdroje eDNA patří půda , oceán, podpovrchová vrstva , horké prameny , hydrotermální průduchy , polární ledovce , hypersalinní stanoviště a extrémní prostředí pH. Z mnoha aplikací metagenomiky vědci jako Jo Handelsman , Jon Clardy a Robert M. Goodman zkoumali metagenomické přístupy k objevu biologicky aktivních molekul, jako jsou antibiotika .

K identifikaci genů, které produkují malé bioaktivní molekuly, byly použity funkční nebo homologické screeningové strategie. Funkční metagenomické studie jsou navrženy tak, aby hledaly specifické fenotypy, které jsou spojeny s molekulami se specifickými charakteristikami. Homologická metagenomická studia jsou na druhé straně navržena tak, aby zkoumala geny k identifikaci konzervovaných sekvencí, které byly dříve spojeny s expresí biologicky aktivních molekul.

Funkční metagenomické studie umožňují objev nových genů, které kódují biologicky aktivní molekuly. Tyto testy zahrnují testy překrytí špičkovým agarem, kde antibiotika generují zóny inhibice růstu proti testovacím mikrobům, a testy pH, které mohou skrínovat změnu pH v důsledku nově syntetizovaných molekul pomocí indikátoru pH na agarové plotně. K hledání genů se specifickými funkcemi byl také použit screening genové exprese vyvolaný substrátem (SIGEX), metoda pro screening exprese genů, které jsou indukovány chemickými sloučeninami. Metagenomické studie založené na homologii vedly k rychlému objevu genů, které mají homologní sekvence jako dříve známé geny, které jsou zodpovědné za biosyntézu biologicky aktivních molekul. Jakmile jsou geny sekvenovány, mohou vědci porovnávat tisíce genomů bakterií současně. Výhodou oproti funkčním metagenomickým testům je, že metagenomické studie homologie nevyžadují k vyjádření metagenomů systém hostitelského organismu, takže tato metoda může potenciálně ušetřit čas strávený analýzou nefunkčních genomů. To také vedlo k objevu několika nových proteinů a malých molekul. Kromě toho in silico vyšetření z Global Ocean Metagenomic Survey našlo 20 nových lantibiotických cykláz.

Kinázy

Posttranslační modifikace proteinů s fosfátovými skupinami kinázami je klíčovým regulačním krokem ve všech biologických systémech. Fosforylační děje, buď fosforylace proteinovými kinázami nebo defosforylace fosfatázami , vedou k aktivaci nebo deaktivaci proteinu. Tyto události mají dopad na regulaci fyziologických drah, což činí schopnost pitvat a studovat tyto cesty nedílnou součástí porozumění detailům buněčných procesů. Existuje řada výzev - jmenovitě samotná velikost fosfoproteomu, prchavý charakter fosforylačních událostí a související fyzická omezení klasických biologických a biochemických technik - které omezily rozvoj znalostí v této oblasti.

Díky použití modulátorů proteinových kináz s malými molekulami získali chemičtí biologové lepší pochopení účinků fosforylace proteinů. Například neselektivní a selektivní inhibitory kinázy, jako je skupina pyridinylimidazolových sloučenin, jsou silnými inhibitory použitelnými při disekci signálních cest kinázy MAP . Tyto pyridinylimidazolové sloučeniny fungují zacílením na vazebnou kapsu ATP . Ačkoli se tento přístup, stejně jako související přístupy, s mírnými modifikacemi osvědčil v řadě případů, tyto sloučeniny postrádají adekvátní specifičnost pro obecnější aplikace. Další třída sloučenin, inhibitory založené na mechanismu, kombinuje znalosti kinázové enzymologie s dříve používanými inhibičními motivy. Například „analog bisubstrátu“ inhibuje působení kinázy vazbou jak konzervované vazebné kapsy ATP, tak rozpoznávacího místa protein/peptid na specifické kináze. Výzkumné skupiny také využívaly analogy ATP jako chemické sondy ke studiu kináz a identifikaci jejich substrátů.

Vývoj nových chemických prostředků pro začlenění fosfomimetických aminokyselin do proteinů poskytl důležitý pohled na účinky fosforylačních událostí. Fosforylační jevy byly typicky studovány mutací identifikovaného fosforylačního místa ( serin , threonin nebo tyrosin ) na aminokyselinu, jako je alanin , kterou nelze fosforylovat. Tyto techniky však přicházejí s omezeními a chemičtí biologové vyvinuli vylepšené způsoby zkoumání fosforylace proteinů. Instalací fosfo-serinových, fosfo-threoninových nebo analogických fosfonátových napodobenin do nativních proteinů jsou vědci schopni provádět in vivo studie ke zkoumání účinků fosforylace prodloužením doby, po kterou dochází k fosforylační události, a zároveň minimalizovat často nepříznivé účinky mutací . Exprimovaná ligace proteinu se ukázala jako úspěšná technika pro syntetickou produkci proteinů, které obsahují fosfomimetické molekuly na obou koncích. Vědci navíc použili nepřirozenou mutagenezi aminokyselin na cílených místech v peptidové sekvenci.

Pokroky v chemické biologii se také zlepšily u klasických technik zobrazování kinázového působení. Například vývoj peptidových biosenzorů - peptidů obsahujících inkorporované fluorofory zlepšil časové rozlišení vazebných testů in vitro. Jednou z nejužitečnějších technik ke studiu působení kinázy je přenos fluorescenční rezonanční energie (FRET) . Aby se využil FRET pro studie fosforylace, fluorescenční proteiny se spojí jak s vazebnou doménou fosfoaminokyseliny, tak s peptidem, který lze fosforylovat. Po fosforylaci nebo defosforylaci substrátového peptidu dochází ke konformační změně, která vede ke změně fluorescence. FRET byl také použit společně s fluorescenční celoživotní zobrazovací mikroskopií (FLIM) nebo fluorescenčně konjugovanými protilátkami a průtokovou cytometrií k poskytnutí kvantitativních výsledků s vynikajícím časovým a prostorovým rozlišením.

Biologická fluorescence

Chemičtí biologové často studují funkce biologických makromolekul pomocí fluorescenčních technik. Výhoda fluorescence oproti jiným technikám spočívá v její vysoké citlivosti, neinvazivnosti, bezpečné detekci a schopnosti modulovat fluorescenční signál. V posledních letech objev zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) Rogerem Y. Tsienem a dalšími, hybridní systémy a kvantové tečky umožnily přesněji posoudit umístění a funkci proteinu. Používají se tři hlavní typy fluoroforů: malá organická barviva, zelené fluorescenční proteiny a kvantové tečky . Malá organická barviva mají obvykle méně než 1 kDa a byla upravena tak, aby zvýšila fotostabilitu a jas a omezila samozhášení. Kvantové tečky mají velmi ostré vlnové délky, vysokou molární absorpci a kvantový výtěžek. Organická barviva ani kvantová barviva nemají schopnost rozpoznávat požadovaný protein bez pomoci protilátek, proto musí používat imunoznačení . Fluorescenční proteiny jsou geneticky kódovány a mohou být fúzovány s požadovaným proteinem. Další technikou genetického značkování je tetracyklinový biarsenický systém, který vyžaduje modifikaci cílené sekvence, která zahrnuje čtyři cysteiny, které váží membránově propustné biarsenické molekuly, zelená a červená barviva „FlAsH“ a „ReAsH“, s pikomolární afinitou. Fluorescenční proteiny i biarsenický tetracykstein mohou být exprimovány v živých buňkách, ale představují významná omezení mimoděložní exprese a mohou způsobit ztrátu funkce.

Byly použity fluorescenční techniky k posouzení řady dynamiky proteinů, včetně sledování proteinů, konformačních změn, interakcí protein -protein, syntézy a obratu bílkovin a enzymatické aktivity. Tři obecné přístupy k měření redistribuce a difúze čisté bílkoviny jsou metody sledování jedné částice, korelační spektroskopie a metody fotomarkingu. Při sledování jedné částice musí být jednotlivé molekuly dostatečně jasné a řídké, aby je bylo možné sledovat z jednoho videa do druhého. Korelační spektroskopie analyzuje kolísání intenzity vyplývající z migrace fluorescenčních objektů do a ven z malého objemu v ohnisku laseru. Při fotomarkingu lze fluorescenční protein v subcelulární oblasti odložit pomocí intenzivního místního osvětlení a osud označené molekuly lze zobrazit přímo. Michalet a spolupracovníci použili kvantové tečky pro sledování jedné částice pomocí biotinových kvantových teček v buňkách HeLa. Jedním z nejlepších způsobů, jak detekovat konformační změny v proteinech, je označit požadovaný protein dvěma fluorofory v těsné blízkosti. FRET bude reagovat na vnitřní konformační změny vyplývající z přeorientování jednoho fluoroforu na druhý. Lze také použít fluorescenci k vizualizaci aktivity enzymu, typicky za použití proteomiky založené na potlačené aktivitě (qABP). Kovalentní vazba qABP na aktivní místo cíleného enzymu poskytne přímý důkaz o tom, zda je enzym zodpovědný za signál po uvolnění zhášeče a obnovení fluorescence.

Viz také

• Chemická genetika
• Chemogenomika

Reference

Další čtení

Deníky

• ACS Chemical Biology - nový časopis o chemické biologii od American Chemical Society.
• Bioorganic & Medicinal Chemistry - The Tetrahedron Journal for Research at the Interface of Chemistry and Biology
• ChemBioChem - evropský žurnál chemické biologie
• Chemická biologie - místo přístupu k novinkám a výzkumu chemické biologie napříč vydavatelstvím RSC
• Buněčná chemická biologie - interdisciplinární časopis, který vydává dokumenty výjimečného zájmu ve všech oblastech na rozhraní mezi chemií a biologií. chembiol.com
• Žurnál chemické biologie - nový časopis vydávající románové dílo a recenze na rozhraní mezi biologií a fyzikálními vědami, vydaný Springerem. odkaz
• Časopis rozhraní královské společnosti -interdisciplinární publikace podporující výzkum na rozhraní mezi fyzickými a biologickými vědami
• Molecular BioSystems -chemický biologický časopis se zvláštním zaměřením na rozhraní mezi chemií a -omickými vědami a biologií systémů.
• Nature Chemical Biology - měsíční multidisciplinární časopis poskytující mezinárodní fórum pro včasné zveřejnění významného nového výzkumu na rozhraní mezi chemií a biologií.
• Wiley Encyclopedia of Chemical Biology odkaz