Cirkulující nádorová buňka - Circulating tumor cell

Cirkulujících nádorových buněk ( CTC ), je buňka, která byla uvolněna do vaskulatury nebo lymfatického systému z primárního nádoru a je nesen kolem těla do krevního oběhu . CTC mohou extravazovat a stát se semeny pro následný růst dalších nádorů ( metastáz ) ve vzdálených orgánech, což je mechanismus, který je zodpovědný za převážnou většinu úmrtí souvisejících s rakovinou. Detekce a analýza CTC může pomoci včasné prognóze pacienta a určit vhodnou léčbu na míru. V současné době existuje jedna metoda FDA schválená pro detekci CTC, CellSearch, která se používá k diagnostice rakoviny prsu , kolorektálního karcinomu a prostaty .

Detekce CTC nebo kapalné biopsie přináší oproti tradičním tkáňovým biopsiím několik výhod. Jsou neinvazivní, lze je použít opakovaně a poskytují užitečnější informace o riziku metastáz, progresi onemocnění a účinnosti léčby. Například analýza vzorků krve od pacientů s rakovinou zjistila sklon ke zvýšené detekci CTC s postupujícím onemocněním. Krevní testy se snadno a bezpečně provádějí a lze v průběhu času odebrat více vzorků. Naproti tomu analýza solidních nádorů vyžaduje invazivní postupy, které by mohly omezit pacientovu compliance. Schopnost sledovat progresi onemocnění v průběhu času by mohla usnadnit vhodnou úpravu terapie pacienta, potenciálně zlepšit jeho prognózu a kvalitu života. Důležitým aspektem schopnosti prognózovat budoucí progresi onemocnění je eliminace (alespoň dočasně) potřeby chirurgického zákroku, když je počet opakovaných CTC nízký a neroste; zřejmé výhody vyhýbání se chirurgickému zákroku zahrnují vyhýbání se riziku souvisejícímu s vrozenou genogenitou nádorových operací. Za tímto účelem byly nedávno vyvinuty technologie s požadovanou citlivostí a reprodukovatelností pro detekci CTC u pacientů s metastatickým onemocněním. Na druhou stranu jsou CTC velmi vzácné, často přítomné pouze jako několik buněk na mililitr krve, což činí jejich detekci poměrně náročnou. Kromě toho často exprimují různé markery, které se liší od pacienta k pacientovi, což ztěžuje vývoj technik s vysokou citlivostí a specificitou .

Typy

CTC pocházející z karcinomů (rakoviny epiteliálního původu, které jsou nejčastější) lze klasifikovat podle exprese epiteliálních markerů, stejně jako podle jejich velikosti a podle toho, zda jsou apoptotické. CTC jsou obecně odolné vůči anoikis, což znamená, že mohou přežít v krevním oběhu, aniž by se přichytily k substrátu.

  1. Tradiční CTC se vyznačují neporušeným životaschopným jádrem; exprese EpCAM a cytokeratinů , které vykazují epiteliální původ; nepřítomnost CD45, což znamená, že buňka není hematopoetického původu; a jejich větší velikost , nepravidelný tvar nebo subcelulární morfologie.
  2. Cytokeratin-negativní CTC jsou charakterizovány nedostatkem EpCAM nebo cytokeratinů, což může indikovat nediferencovaný fenotyp (cirkulující kmenové buňky rakoviny ) nebo získání mezenchymálního fenotypu (známý jako epiteliálně-mezenchymální přechod nebo EMT). Tyto populace CTC mohou být nejodolnější a nejvíce náchylné k metastázám. Jsou také obtížněji izolovatelné, protože neexprimují ani cytokeratiny, ani CD45. Jinak je jejich morfologie, genová exprese a genomika podobná morfologii jiných rakovinných buněk.
  3. Apoptotické CTC jsou tradiční CTC, které podstupují apoptózu (programovaná buněčná smrt). Ty mohou být použity k monitorování léčebné odpovědi, jak bylo experimentálně provedeno metodou Epic Sciences, která identifikuje fragmentaci jader nebo cytoplazmatické bubliny spojené s apoptózou. Měření poměru tradičních CTC k apoptotickým CTC - od základní linie k terapii - poskytuje vodítka k účinnosti léčby při cílení a zabíjení rakovinotvorných buněk.
  4. Malé CTC jsou cytokeratin-pozitivní a CD45-negativní, ale mají velikost a tvar podobný bílým krvinkám. Důležité je, že malé CTC mají biomarkery specifické pro rakovinu, které je identifikují jako CTC. Malé CTC se podílejí na progresivním onemocnění a diferenciaci na malobuněčné karcinomy, které často vyžadují jiný terapeutický průběh.

CTC klastry

CTC klastry jsou dva nebo více jednotlivých CTC spojených dohromady. CTC cluster může obsahovat tradiční, malé nebo CK-CTC. Tyto klastry mají biomarkery specifické pro rakovinu, které je identifikují jako CTC. Několik studií uvádí, že přítomnost těchto klastrů je spojena se zvýšeným rizikem metastáz a špatnou prognózou. Jedna studie zahrnující rakovinu prostaty například ukázala osmkrát delší průměrnou míru přežití u pacientů s pouze jedním CTC oproti pacientům s CTC klastry, zatímco jiné studie ukázaly podobné korelace u rakoviny tlustého střeva. Výčet CTC klastrů může navíc poskytnout užitečné prognostické informace pro pacienty s již zvýšenými hladinami CTC.

Jedna studie však uvádí, že na rozdíl od stávajícího konsensu je přinejmenším diskrétní populace těchto klastrů nezhoubná a místo toho pochází z endotelu tumoru. Tyto cirkulující nádorové endoteliální klastry také vykazují epiteliálně-mezenchymální markery, ale neodrážejí genetiku primárního nádoru.

Dříve se předpokládalo, že klastry CTC nemohou procházet úzkými nádobami, jako jsou kapiláry, kvůli jejich celkové velikosti. Ukázalo se však, že klastry CTC se mohou „odvíjet“ prostřednictvím „selektivního štěpení mezibuněčných adhezí“, aby se tato omezení mohla procházet v jednom souboru, a poté proces zvrátit, jakmile bude jasný. Toto chování by mohlo být faktorem, proč mají klastry CTC tak významný metastatický potenciál.

Frekvence

Počet různých typů krevních buněk v plné krvi versus CTC.

Detekce CTC může mít důležité prognostické a terapeutické důsledky, ale protože jejich počet může být velmi malý, tyto buňky nelze snadno detekovat. Odhaduje se, že mezi buňkami, které se oddělily od primárního nádoru, může pouze 0,01% tvořit metastázy.

Cirkulující nádorové buňky se u pacientů s metastatickým onemocněním nacházejí ve frekvencích řádově 1-10 CTC na ml plné krve. Pro srovnání, ml krve obsahuje několik milionů bílých krvinek a miliardu červených krvinek. Tato nízká frekvence spojená s obtížností identifikace rakovinotvorných buněk znamená, že klíčová složka porozumění biologickým vlastnostem CTC vyžaduje technologie a přístupy schopné izolovat 1 CTC na ml krve, a to buď obohacením, nebo ještě lépe pomocí testů bez obohacení, které identifikují všechny podtypy CTC v dostatečně vysokém rozlišení, aby uspokojily požadavky na množství obrazu diagnostické patologie u pacientů s různými typy rakoviny. Dosud byly CTC detekovány u několika rakovin epitelu (prsu, prostaty, plic a tlustého střeva) a klinické důkazy naznačují, že u pacientů s metastatickými lézemi je větší pravděpodobnost izolování CTC.

CTC jsou obvykle (v roce 2011) zachyceny z vaskulatury pomocí specifických protilátek schopných rozpoznat specifický nádorový marker (obvykle EpCAM ); tento přístup je však zkreslený potřebou dostatečné exprese vybraného proteinu na buněčném povrchu, což je událost nezbytná pro krok obohacení. Navíc, protože EpCAM a jiné proteiny (např. Cytokeratiny ) nejsou v některých nádorech exprimovány a mohou být down -regulovány během přechodu epitelu na mezenchym ( EMT ), jsou nutné nové strategie obohacování.

První důkaz naznačuje, že CTC markery používané v humánní medicíně jsou konzervovány i u jiných druhů. Pět z běžnějších markerů včetně CK19 je také užitečných pro detekci CTC v krvi psů s maligními nádory mléčné žlázy. Novější přístupy jsou schopny identifikovat více buněk ze 7,5 ml krve, jako IsofFux nebo Maintrac. Ve velmi vzácných případech jsou CTC přítomny v dostatečně velkém množství, aby byly viditelné při rutinním vyšetření krevního nátěru . Toto se označuje jako rakovinotvorná nebo karcinomová buněčná leukémie a je spojeno se špatnou prognózou.

Detekční metody

Kaplan Meier Analýza celkového přežití před zahájením nové linie terapie u pacientek s metastatickým karcinomem prsu, kolorektálního karcinomu a prostaty. Pacienti byli rozděleni na pacienty s příznivým a nepříznivým CTC (nepříznivé:> 5 CTC/7,5 ml pro prsa a prostatu,> 3 CTC/7,5 ml pro tlusté střevo)

K dnešnímu dni byla vyvinuta řada výzkumných metod k izolaci a výčtu CTC. Jedinou metodikou pro vyčíslení CTC v plné krvi schválenou Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) je systém CellSearch. Rozsáhlé klinické testování provedené pomocí této metody ukazuje, že přítomnost CTC je silným prognostickým faktorem pro celkové přežití u pacientů s metastazujícím karcinomem prsu, kolorektálního karcinomu nebo prostaty.

CTC jsou klíčové pro pochopení biologie metastáz a slibují potenciál jako biomarker pro neinvazivní hodnocení progrese nádoru a reakce na léčbu. Izolace a charakterizace CTC však představují hlavní technologickou výzvu, protože CTC tvoří minutový počet celkových buněk v cirkulující krvi, 1–10 CTC na ml plné krve ve srovnání s několika miliony bílých krvinek a miliardou červené krve buňky. Hlavní výzvou pro výzkumníky CTC je proto převládající obtížnost čištění CTC, která umožňuje molekulární charakterizaci CTC. Bylo vyvinuto několik metod k izolaci CTC v periferní krvi a v podstatě spadají do dvou kategorií: biologické metody a fyzikální metody, stejně jako hybridní metody, které kombinují obě strategie. Techniky mohou být také klasifikovány podle toho, zda vybírají CTC k izolaci (pozitivní výběr) nebo zda vylučují všechny krvinky (negativní výběr).

Biologické metody

Biologické metody izolují buňky na základě vysoce specifické vazby antigenu, nejčastěji monoklonálními protilátkami pro pozitivní selekci. Byly použity protilátky proti nádorově specifickým biomarkerům včetně EpCAM , HER2 a PSA . Nejběžnější technikou je separace na bázi magnetických nanočástic (imunomagnetický test), jak se používá v CellSearch nebo MACS . Mezi další zkoumané techniky patří mikrofluidní separace a kombinace imunomagnetického testu a mikrofluidní separace. Při vývoji technologie mikrofabrikace jsou implementovány magnetické struktury v mikroúrovni, které poskytují lepší kontrolu magnetického pole a pomáhají detekci CTC. K detekci a identifikaci CTC jsou vyvinuty onkolytické viry, jako jsou viry vakcinie . Existují alternativní metody, které místo protilátek používají upravené proteiny , jako například protein VAR2CSA malárie , který se na povrchu CTC váže na onkofetální chondroitin sulfát . CTC lze také získat přímo z krve modifikovanou Seldingerovou technikou vyvinutou společností GILUPI GmbH. Kovový drát potažený protilátkou se vloží do periferní žíly a zůstane tam po definovanou dobu (30 minut). Během této doby se CTC z krve mohou vázat na protilátky (v současné době anti-EpCAM). Po inkubační době se drát odstraní, promyje a nativní CTC, izolované z krve pacienta, lze dále analyzovat. Je možná molekulární genetika i imunofluorescenční barvení a několik dalších metod. Výhodou této metody je vyšší objem krve, který lze analyzovat na CTC (přibližně 750 ml za 30 minut ve srovnání se 7,5 ml odebraného vzorku krve).

Metoda CellSearch

CellSearch je jedinou platformou schválenou FDA pro izolaci CTC. Tato metoda je založena na použití nanočástic železa potažených polymerní vrstvou nesoucí analogy biotinu a konjugovaných s protilátkami proti EpCAM k zachycení CTC. Izolace je spojena s analyzátorem a pořizuje snímky izolovaných buněk po jejich barvení specifickými fluorescenčními konjugáty protilátek. Krev se odebírá do zkumavky EDTA s přidaným konzervantem. Po příjezdu do laboratoře se 7,5 ml krve odstředí a umístí do přípravného systému. Tento systém nejprve imunomagneticky obohacuje nádorové buňky pomocí nanočástic ferrofluidu a magnetu. Získané buňky se následně permeabilizují a obarví nukleárním barvivem, fluorescenčním protilátkovým konjugátem proti CD45 (leukocytový marker) a cytokeratinům 8 , 18 a 19 (epiteliální markery). Vzorek je poté naskenován na analyzátoru, který pořizuje snímky jaderných, cytokeratinových a CD45 skvrn. Aby byla buňka považována za CTC, musí obsahovat jádro, být pozitivní na cytoplazmatickou expresi cytokeratinu a také negativní na expresi CD45 markeru a mít průměr větší než 5 µm. Pokud je celkový počet nádorových buněk, u nichž bylo shledáno, že splňují výše uvedená kritéria, 5 nebo více, je vzorek krve pozitivní. Ve studiích prováděných na pacientech s rakovinou prostaty, prsu a tlustého střeva je medián přežití metastatických pacientů s pozitivními vzorky přibližně polovina mediánu přežití u metastatických pacientů s negativními vzorky. Tento systém se vyznačuje schopností obnovy 93% a detekčním limitem jednoho CTC na 7,5 ml plné krve. U konkrétních typů rakoviny vykazovaly alternativní metody, jako je IsoFlux, větší citlivost .

Metoda Parsortix

Tato automatizovaná metoda využívá filtraci velikosti k obohacení větších a méně stlačitelných cirkulujících nádorových buněk z jiných krevních složek. Systém Parsortix může odebírat vzorky krve v rozmezí od 1 ml do 40 ml. Jednorázová mikrofluidní kazeta s mezerou 6,5 mikronů umožňuje průchod drtivé většině červených krvinek a bílých krvinek, zatímco větší vzácné buňky, včetně cirkulujících nádorových buněk a buněk plodu, se zachytí. Zachycené buňky mohou být buď automaticky obarveny protilátkami pro identifikaci, nebo mohou být uvolněny z kazety. Tyto uvolněné / sklizené buňky jsou živé a mohou být analyzovány navazujícími buněčnými a molekulárními technikami a také kultivovány. Filtrační kazeta zachycuje nepřeberné množství různých typů rakovinných buněk.

Metoda epických věd

Tato metoda zahrnuje technologii k oddělení jaderných buněk od červených krvinek, kterým chybí jádro. Všechny nukleované buňky, včetně normálních bílých krvinek a CTC, jsou vystaveny fluorescenčně značeným protilátkám specifickým pro rakovinné biomarkery. Zobrazovací systém společnosti Epic navíc pořizuje snímky všech buněk na sklíčku (přibližně 3 miliony), zaznamenává přesné souřadnice každé buňky a analyzuje každou buňku na 90 různých parametrů, včetně intenzity fluorescence čtyř fluorescenčních markerů a 86 různých morfologické parametry. Epic může také použít FISH a další techniky barvení k hledání abnormalit, jako jsou duplikace, delece a přeskupení. Technologie zobrazování a analýzy také umožňuje, aby byly známy souřadnice každé buňky na sklíčku, takže ze sklíčka lze získat jednu buňku pro analýzu pomocí sekvenování nové generace. Algoritmus vycvičený hematopatologií zahrnuje četná morfologická měření a také expresi z cytokeratinu a CD45. Algoritmus poté navrhne kandidátské CTC, které vyškolený čtenář potvrdí. Zajímavé buňky jsou analyzovány na relevantní fenotypové a genotypové markery, přičemž regionální bílé krvinky jsou zahrnuty jako negativní kontroly. Molekulární testy společnosti Epic měří expresi proteinů a také vyšetřují genomové abnormality v CTC u více než 20 různých typů rakoviny.

Maintrac

Maintrac je platforma pro diagnostické krevní testy využívající mikroskopické diagnostické metody in vitro k identifikaci vzácných buněk v tělních tekutinách a jejich molekulárních charakteristik. Je založen na pozitivní selekci pomocí protilátek specifických pro EpCAM. Maintrac používá přístup založený na mikroskopické identifikaci cirkulujících nádorových buněk. Aby se zabránilo poškození a ztrátě buněk během procesu, používá Maintrac pouze dva kroky k identifikaci. Na rozdíl od mnoha jiných metod maintrac buňky nečistí ani neobohacuje, ale identifikuje je v kontextu ostatních krevních sloučenin. K získání životně důležitých buněk a ke snížení stresu těchto buněk se krvinky připraví pouze jedním centrifugačním krokem a lýzou erytrocytů. Stejně jako CellSearch používá maintrac protilátku EpCAM. Neslouží však k obohacení, ale jako fluorescenční marker k identifikaci těchto buněk. Spolu s jaderným barvením propidium jodidem může metoda maintrac rozlišovat mezi mrtvými a živými buňkami. Jako potenciální nádorové buňky jsou počítány pouze vitální, propidium vylučující buňky pozitivní na EpCAM. Pouze živé buňky mohou růst do nádorů, takže umírání buněk pozitivních na EpCAM nemůže způsobit žádnou škodu. Suspenze se analyzuje fluorescenční mikroskopií, která automaticky počítá události. Simultánně se zaznamenávají galerie událostí, aby se ověřilo, zda software našel skutečnou živou buňku, a aby například rozlišoval mezi epiteliálními buňkami kůže. Důkladná validace metody ukázala, že další protilátky cytokeratinů nebo CD45 neměly žádnou výhodu.

Na rozdíl od jiných metod maintrac nepoužívá počet jednotlivých buněk jako prognostický ukazatel, ale Maintrac spíše využívá dynamiku počtu buněk. Stoupající počet nádorových buněk je důležitým faktorem pokračující nádorové aktivity. Snížení počtu buněk je znakem úspěšné terapie. Proto lze maintrac použít k ověření úspěchu chemoterapie a k dohledu nad léčbou během hormonální nebo udržovací terapie Maintrac byl experimentálně použit ke sledování recidivy rakoviny. Studie používající Maintrac ukázaly, že buňky pozitivní na EpCAM lze nalézt v krvi u pacienta bez rakoviny. Zánětlivá onemocnění, jako je Crohnova choroba, také vykazují zvýšené hladiny buněk pozitivních na EpCAM. Pacienti s těžkými popáleninami kůže mohou také nosit pozitivní buňky EpCAM v krvi. Použití buněk pozitivních na EpCAM jako nástroje pro včasnou diagnostiku proto není optimální.

Fyzikální metody

Fyzikální metody jsou často založeny na filtrech a umožňují zachycení CTC podle velikosti, nikoli podle konkrétních epitopů . ScreenCell je zařízení založené na filtraci, které umožňuje citlivou a specifickou izolaci CTC z lidské plné krve během několika minut. Periferní krev je odebrána a zpracována do 4 hodin pomocí izolačního zařízení ScreenCell k zachycení CTC. Zachycené buňky jsou připraveny pro buněčnou kulturu nebo pro přímou charakterizaci pomocí hybridizačního testu ViewRNA in situ. Metoda Parsortix odděluje CTC na základě jejich velikosti a deformovatelnosti.

Hybridní metody

Hybridní metody kombinují fyzickou separaci (pomocí gradientů, magnetických polí atd.) S obnovou buněk zprostředkovanou protilátkou. Příkladem toho je citlivá dvojitá gradientová centrifugace a metoda detekce a enumerace třídění buněk, která byla použita k detekci cirkulujících buněk epiteliálního karcinomu u pacientů s rakovinou prsu negativní selekcí. Princip negativní selekce je založen na získávání všech krevních buněk pomocí panelu protilátek a tradiční gradientové centrifugaci s Ficollem . K detekci cirkulujících buněk rakoviny prostaty byla použita podobná metoda známá jako ISET Test a k izolaci CTC od malobuněčných pacientů s rakovinou plic byla použita jiná technika známá jako RosetteStep . Podobně vědci z Massachusetts General Hospital vyvinuli metodu negativní selekce, která využívá inerciální zaostřování na mikrofluidní zařízení . Technika, nazývaná CTC-iChip, nejprve odstraní buňky příliš malé na to, aby to byly CTC, jako jsou červené krvinky, a poté pomocí magnetických částic odstraní bílé krvinky.

Charakterizace CTC

Některé léky jsou zvláště účinné proti rakovině, která splňuje určité požadavky. Například Herceptin je velmi účinný u pacientů, kteří jsou Her2 pozitivní, ale mnohem méně účinný u pacientů, kteří jsou Her2 negativní. Jakmile je primární nádor odstraněn, biopsie současného stavu rakoviny prostřednictvím tradiční typizace tkáně již není možná. K typizaci se často používají tkáňové řezy primárního nádoru, odstraněné před lety. Další charakterizace CTC může pomoci určit současný fenotyp tumoru. Byly provedeny testy FISH na CTC a také stanovení stavu IGF-1R , Her2, Bcl-2 , ERG , PTEN , AR pomocí imunofluorescence . Jednobuněčnou qPCR lze také provést s CTC izolovanými z krve.

Orgánový tropismus pacientských CTC byl zkoumán na myším modelu. CTC izolované od pacientů s rakovinou prsu a rozšířené in vitro ukázaly, že mohou u myší generovat kostní, plicní, vaječníkové a mozkové metastázy, což částečně odráží sekundární léze nalezené u odpovídajících pacientů. Je pozoruhodné, že jedna linie CTC - izolovaná dlouho před výskytem mozkových metastáz u pacienta - byla vysoce kompetentní pro generování mozkových metastáz u myší. Toto byl první prediktivní případ mozkových metastáz a důkaz koncepce, že vnitřní molekulární vlastnosti metastatických prekurzorů mezi CTC by mohly poskytnout nový pohled na mechanismy metastáz.

Buněčná morfologie

Morfologický vzhled je posuzován lidskými operátory, a proto podléhá velkým rozdílům mezi operátory. Existuje několik metod výčtu CTC, které používají morfologický vzhled k identifikaci CTC, které mohou také aplikovat různá morfologická kritéria. Nedávná studie rakoviny prostaty ukázala, že mnoho různých morfologických definic cirkulujících nádorových buněk má podobnou prognostickou hodnotu, přestože se absolutní počet buněk nalezených u pacientů a normálních dárců mezi různými morfologickými definicemi pohyboval více než deset let.

Dějiny

CTC byly poprvé pozorovány v roce 1869 v krvi muže s metastazujícím rakovinou Thomasem Ashworthem, který postuloval, že „buňky identické s buňkami samotné rakoviny, které jsou vidět v krvi, mohou mít tendenci vrhnout určité světlo na způsob původu více nádorů existujících u stejné osoby “. Důkladné srovnání morfologie cirkulujících buněk s nádorovými buňkami z různých lézí vedlo Ashwortha k závěru, že „Jedna věc je jistá, že pokud [CTC] pocházely ze stávající rakovinné struktury, musely projít větší částí oběhový systém dorazil do vnitřní saphena žíly zvukové nohy “.

Význam CTC v moderním výzkumu rakoviny začal v polovině devadesátých let demonstrací, že CTC existují již v průběhu onemocnění. Tyto výsledky byly umožněny mimořádně citlivou technologií magnetické separace využívající ferrofluidy (koloidní magnetické nanočástice) a magnetické separátory s vysokým gradientem vynalezené Paulem Libertim a motivované teoretickými výpočty Libertiho a Leona Terstappena, které ukázaly, že velmi malé tumory shazují buňky na méně než 1,0% na den by měly vyústit v detekovatelné buňky v krvi. Od té doby byla na výčet a identifikaci CTC použita řada dalších technologií.

Moderní výzkum rakoviny prokázal, že CTC pocházejí z klonů v primárním nádoru, což potvrzuje Ashworthovy poznámky. Významné úsilí vynaložené na pochopení biologických vlastností CTC prokázalo kritickou roli cirkulujících nádorových buněk při metastatickém šíření karcinomu . Kromě toho vysoce citlivá jednobuněčná analýza prokázala vysokou úroveň heterogenity pozorovanou na úrovni jednotlivých buněk jak pro expresi proteinu, tak pro lokalizaci proteinu, a CTC odrážely jak primární biopsii, tak změny pozorované v metastatických místech.

Reference