RNA polymeráza - RNA polymerase
| DNA polymerovaná RNA polymeráza | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 RNA polymeráza hetero27mer, lidská
| |||||||||
| Identifikátory | |||||||||
| Č. ES | 2.7.7.6 | ||||||||
| Č. CAS | 9014-24-8 | ||||||||
| Databáze | |||||||||
| IntEnz | Pohled IntEnz | ||||||||
| BRENDA | BRENDA vstup | ||||||||
| EXPAS | Pohled NiceZyme | ||||||||
| KEGG | KEGG vstup | ||||||||
| MetaCyc | metabolická cesta | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| PDB struktury | Součet RCSB PDB PDBe PDB | ||||||||
| Genová ontologie | Amigo / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
V molekulární biologii je RNA polymeráza (zkráceně RNAP nebo RNApol a oficiálně na DNA řízená (závislá) RNA polymeráza ) enzym, který syntetizuje RNA z DNA templátu.
Pomocí enzymu helikázy RNAP lokálně otevírá dvouvláknovou DNA, takže jedno vlákno exponovaných nukleotidů lze použít jako templát pro syntézu RNA, což je proces nazývaný transkripce . Transkripční faktor a jeho přidružené transkripce mediátor komplex musí být připojena k vazebné místo DNA nazývá promotorová oblast před RNAP může iniciovat DNA odvíjení v této poloze. RNAP nejen iniciuje transkripci RNA, ale také vede nukleotidy do polohy, usnadňuje přichycení a prodloužení , má vlastní schopnosti korektury a nahrazení a schopnost rozpoznávat ukončení. V eukaryotech může RNAP vytvářet řetězce dlouhé až 2,4 milionu nukleotidů.
RNAP produkuje RNA, která je funkčně buď pro kódování proteinu , tj. Messenger RNA (mRNA); nebo nekódující (takzvané „geny RNA“). Existují nejméně čtyři funkční typy RNA genů:
- transfer RNA (tRNA) - přenáší specifické aminokyseliny do rostoucích polypeptidových řetězců v ribozomálním místě syntézy proteinů během translace ;
- ribozomální RNA (rRNA) - včleňuje se do ribozomů;
- mikro RNA (miRNA) - reguluje genovou aktivitu; a,
- katalytická RNA ( ribozym ) - funguje jako enzymaticky aktivní molekula RNA.
RNA polymeráza je nezbytná pro život a nachází se ve všech živých organismech a mnoha virech . V závislosti na organismu může být RNA polymeráza proteinovým komplexem (více podjednotka RNAP) nebo se může skládat pouze z jedné podjednotky (jedna podjednotka RNAP, ssRNAP), z nichž každá představuje nezávislou linii. První z nich se nachází v bakteriích , archeach a eukaryotech , které mají podobnou základní strukturu a mechanismus. Ten se nachází ve fágech i v eukaryotických chloroplastech a mitochondriích a souvisí s moderními DNA polymerázami . Eukaryotické a archaealní RNAP mají více podjednotek než bakteriální a jsou ovládány odlišně.
Bakterie a archea mají pouze jednu RNA polymerázu. Eukaryoty mají více typů jaderných RNAP, z nichž každý je zodpovědný za syntézu odlišné podskupiny RNA:
- RNA polymeráza I syntetizuje pre-rRNA 45 S (35S v kvasinkách ), která zraje a vytvoří hlavní RNA úseky ribozomu.
- RNA polymeráza II syntetizuje prekurzory mRNA a většiny sRNA a mikroRNA.
- RNA polymeráza III syntetizuje tRNA, rRNA 5S a další malé RNA nalezené v jádru a cytosolu .
- RNA polymeráza IV a V nacházející se v rostlinách jsou méně chápány; dělají siRNA . Kromě ssRNAP také chloroplasty kódují a používají bakterie podobný RNAP.
Struktura
Nobelovu cenu za chemii za rok 2006 získal Roger D. Kornberg za vytvoření detailních molekulárních obrazů RNA polymerázy v různých fázích transkripčního procesu.
Ve většině prokaryot přepisuje všechny druhy RNA jeden druh polymerázy RNA. „Jádro“ RNA polymerázy z E. coli se skládá z pěti podjednotek: dvě alfa (α) podjednotky 36 kDa , beta (β) podjednotka 150 kDa, beta primární podjednotka (β ′) 155 kDa a malá omega (ω) podjednotka. Faktor sigma (σ) se váže na jádro a tvoří holoenzym. Po zahájení transkripce se faktor může uvolnit a nechat jádrový enzym pokračovat ve své práci. Komplex jádrové RNA polymerázy tvoří strukturu „krabí dráp“ nebo „upínací čelist“ s vnitřním kanálem probíhajícím po celé délce. Eukaryotické a archaeal RNA polymerázy mají podobnou základní strukturu a fungují podobným způsobem, i když mají mnoho podjednotek navíc.
Všechny RNAP obsahují kovové kofaktory , zejména kationty zinku a hořčíku, které pomáhají v procesu transkripce.
Funkce
Řízení procesu genové transkripce ovlivňuje vzorce genové exprese, a tím umožňuje buňce přizpůsobit se měnícímu se prostředí, provádět specializované role v organismu a udržovat základní metabolické procesy nezbytné pro přežití. Proto není překvapením, že aktivita RNAP je dlouhá, složitá a vysoce regulovaná. U bakterií Escherichia coli bylo identifikováno více než 100 transkripčních faktorů , které modifikují aktivitu RNAP.
RNAP může iniciovat transkripci na specifických sekvencích DNA známých jako promotory . Poté produkuje řetězec RNA, který je komplementární k vláknu templátu DNA. Proces přidávání nukleotidů do řetězce RNA je znám jako prodloužení; v eukaryotech může RNAP budovat řetězce dlouhé až 2,4 milionu nukleotidů (celá délka genu dystrofinu ). RNAP bude přednostně uvolňovat svůj transkript RNA ve specifických sekvencích DNA kódovaných na konci genů, které jsou známé jako terminátory .
Mezi produkty RNAP patří:
- Messenger RNA (mRNA) -template pro syntézu proteinů podle ribozomů .
-
Nekódující RNA nebo „RNA geny“-široká třída genů, které kódují RNA, která není translatována do proteinu. Nejvýraznějšími příklady RNA genů jsou transferová RNA (tRNA) a ribozomální RNA (rRNA), které se oba podílejí na procesu translace . Od konce devadesátých let však bylo nalezeno mnoho nových genů RNA, a proto mohou geny RNA hrát mnohem významnější roli, než se dříve předpokládalo.
- Transfer RNA (tRNA) - přenáší specifické aminokyseliny na rostoucí polypeptidové řetězce v ribozomálním místě syntézy proteinů během translace
- Ribozomální RNA (rRNA) - součást ribozomů
- Micro RNA — reguluje genovou aktivitu
- Catalytic RNA ( Ribozyme ) —enzymaticky aktivní molekuly RNA
RNAP dosahuje de novo syntézy . Je toho schopen, protože specifické interakce s iniciačním nukleotidem drží RNAP pevně na svém místě, což usnadňuje chemický útok na přicházející nukleotid. Takové specifické interakce vysvětlují, proč RNAP upřednostňuje spouštění transkriptů pomocí ATP (následované GTP, UTP a poté CTP). Na rozdíl od DNA polymerázy zahrnuje RNAP aktivitu helikázy , proto k odvíjení DNA není potřeba žádný samostatný enzym.
Akce
Zahájení
Vazba RNA polymerázy v bakteriích zahrnuje sigma faktor rozpoznávající jádrovou promotorovou oblast obsahující prvky -35 a -10 (umístěné před začátkem transkribované sekvence) a také u některých promotorů promotor rozpoznávající C-terminální doménu α podjednotky proti proudu elementy. Existuje několik zaměnitelných faktorů sigma, z nichž každý rozpoznává odlišnou sadu promotorů. Například v E. coli je σ 70 exprimován za normálních podmínek a rozpoznává promotory pro geny požadované za normálních podmínek („ housekeeping geny “), zatímco σ 32 rozpoznává promotory pro geny vyžadované při vysokých teplotách („ geny tepelného šoku “) . U archea a eukaryot jsou funkce bakteriálního obecného transkripčního faktoru sigma prováděny několika obecnými transkripčními faktory, které spolupracují. Uzavřený komplex RNA polymerázy a promotoru se obvykle označuje jako „ komplex preiniciace transkripce “.
Po navázání na DNA přechází RNA polymeráza z uzavřeného komplexu do otevřeného komplexu. Tato změna zahrnuje oddělení řetězců DNA za vzniku odvinutého úseku DNA přibližně 13 bp, označovaného jako „ transkripční bublina “. Supercoiling hraje důležitou roli v polymerázové aktivitě kvůli odvíjení a převíjení DNA. Protože se oblasti DNA před RNAP odvíjejí, existují kompenzační pozitivní supercívky. Regiony za RNAP se přetočí a jsou přítomny negativní supercívky.
Útěk promotéra
RNA polymeráza poté začne syntetizovat počáteční heteroduplex DNA-RNA, přičemž ribonukleotidové páry jsou spárovány s vláknem templátu DNA podle interakcí párování bází Watson-Crick. Jak je uvedeno výše, RNA polymeráza navazuje kontakty s promotorovou oblastí. Tyto stabilizační kontakty však inhibují schopnost enzymu přistupovat k DNA dále po proudu a tím i syntézu produktu plné délky. Aby mohla pokračovat RNA syntéza, musí RNA polymeráza uniknout promotoru. Musí udržovat kontakty promotoru a zároveň odvíjet více downstream DNA pro syntézu, „škrábat“ více downstream DNA do iniciačního komplexu. Během únikového přechodu promotoru je RNA polymeráza považována za „stresovaný meziprodukt“. Termodynamicky se stres hromadí z činností odvíjení DNA a zhutňování DNA. Jakmile je heteroduplex DNA-RNA dostatečně dlouhý (~ 10 bp), RNA polymeráza uvolní své upstream kontakty a efektivně dosáhne únikového přechodu promotoru do fáze prodloužení. Heteroduplex v aktivním centru stabilizuje komplex prodloužení.
Útěk promotéra však není jediným výsledkem. RNA polymeráza může také uvolnit stres uvolněním kontaktů po proudu a zastavit transkripci. Pozastavený transkripční komplex má dvě možnosti: (1) uvolnit rodící se transkript a začít znovu na promotoru nebo (2) obnovit nový 3'OH na rodícím se transkriptu na aktivním místě prostřednictvím katalytické aktivity RNA polymerázy a znovu zahájit skriptování DNA, aby se dosáhlo útěk promotéra. Abortivní zahájení , neproduktivní cyklování RNA polymerázy před únikovým přechodem promotoru, má za následek krátké fragmenty RNA kolem 9 bp v procesu známém jako abortivní transkripce. Rozsah abortivní iniciace závisí na přítomnosti transkripčních faktorů a síle kontaktů promotoru.
Prodloužení
17-bp transkripční komplex má hybrid DNA-RNA o 8 bp, to znamená, že 8 párů bází zahrnuje transkript RNA navázaný na vlákno templátu DNA. Jak transkripce postupuje, ribonukleotidy se přidají na 3 'konec transkriptu RNA a komplex RNAP se pohybuje podél DNA. Charakteristické rychlosti prodloužení u prokaryot a eukaryot jsou přibližně 10–100 nts/s.
Aspartylové ( asp ) zbytky v RNAP budou držet ionty Mg 2+ , které zase budou koordinovat fosfáty ribonukleotidů. První Mg 2+ bude držet přidaný α-fosfát NTP. To umožňuje nukleofilní útok 3'OH z transkriptu RNA a přidání dalšího NTP do řetězce. Druhý Mg 2+ bude držet pyrofosfát NTP. Celková reakční rovnice je:
- (NMP) n + NTP → (NMP) n + 1 + PP i
Věrnost
Na rozdíl od mechanismů korektury DNA polymerázy byly RNAP zkoumány teprve nedávno. Korektura začíná separací chybně začleněného nukleotidu z templátu DNA. Tím se přepis pozastaví. Polymeráza pak ustupuje o jednu polohu a štěpí dinukleotid, který obsahuje nesprávně spárovaný nukleotid. V RNA polymeráze k tomu dochází na stejném aktivním místě, které se používá pro polymeraci, a je tedy výrazně odlišné od DNA polymerázy, kde ke korektuře dochází na odlišném aktivním místě nukleázy.
Celková chybovost se pohybuje kolem 10–4 až 10–6 .
Ukončení
U bakterií může být ukončení transkripce RNA rho-dependentní nebo rho-independentní. První z nich se spoléhá na faktor rho , který destabilizuje heteroduplex DNA-RNA a způsobuje uvolnění RNA. Ten, také známý jako vnitřní ukončení , se opírá o palindromickou oblast DNA. Přepis oblasti způsobuje vytvoření struktury „vlásenky“ z transkripční smyčky RNA a vazby na sebe. Tato struktura vlásenky je často bohatá na páry párů bází GC, díky čemuž je stabilnější než samotný hybrid DNA-RNA. Výsledkem je, že hybrid DNA-RNA 8 bp v transkripčním komplexu se přesune na hybrid 4 bp. Tyto poslední 4 páry bází jsou slabé páry bází AU a celý transkript RNA odpadne z DNA.
Ukončení transkripce u eukaryot je méně dobře srozumitelné než u bakterií, ale zahrnuje štěpení nového transkriptu, po kterém následuje adice adenin nezávislá na šabloně na jeho novém 3 'konci, v procesu zvaném polyadenylace .
Jiné organismy
Vzhledem k tomu, že DNA i RNA polymerázy provádějí polymeraci nukleotidů závislou na templátu, dalo by se očekávat, že tyto dva typy enzymů budou strukturně příbuzné. Nicméně, rentgenové krystalografické studie obou typů enzymů ukazují, že jiné než obsahující kritické Mg 2+ iontu v katalytickém místě, jsou v podstatě nezávislé na sobě navzájem; skutečně se zdá, že templátově závislé nukleotidové polymerizační enzymy vznikly nezávisle dvakrát během rané evoluce buněk. Jedna linie vedla k moderním DNA polymerázám a reverzním transkriptázám, stejně jako k několika jednojednotkovým RNA polymerázám (ssRNAP) z fágů a organel. Druhá vícepodjednotková linie RNAP tvořila všechny moderní buněčné RNA polymerázy.
Bakterie
U bakterií stejný enzym katalyzuje syntézu mRNA a nekódující RNA (ncRNA) .
RNAP je velká molekula. Jádrový enzym má pět podjednotek (~ 400 kDa ):
- β ': Podjednotka β' je největší podjednotkou a je kódována genem rpoC. P 'podjednotka obsahuje část aktivního centra zodpovědného za syntézu RNA a obsahuje některé determinanty interakcí nespecificky specifických s DNA a rodící se RNA. Je rozdělen na dvě podjednotky v sinicích a chloroplastech.
- β: Podjednotka β je druhou největší podjednotkou a je kódována genem rpoB . Podjednotka β obsahuje zbytek aktivního centra zodpovědného za syntézu RNA a obsahuje zbytek determinant pro interakce nesekvenčně specifické s DNA a rodící se RNA.
- α: Podjednotka α je třetí největší podjednotkou a je přítomna ve dvou kopiích na molekulu RNAP, α I a α II (jedna a dvě). Každá α podjednotka obsahuje dvě domény: αNTD (N-koncová doména) a αCTD (C-koncová doména). αNTD obsahuje determinanty pro sestavení RNAP. αCTD (C-koncová doména) obsahuje determinanty interakce s promotorovou DNA, což umožňuje nesekvenční nespecifické interakce u většiny promotorů a sekvenčně specifické interakce u promotorů obsahujících upstream element a obsahuje determinanty interakcí s regulačními faktory.
- ω: Podjednotka ω je nejmenší podjednotka. Podjednotka ω usnadňuje sestavení RNAP a stabilizuje sestavený RNAP.
Aby se vázala promotory, jádro RNAP se spojuje s faktorem iniciace transkripce sigma (σ) za vzniku holoenzymu RNA polymerázy. Sigma snižuje afinitu RNAP k nespecifické DNA a současně zvyšuje specificitu pro promotory, což umožňuje zahájení transkripce na správných místech. Kompletní holoenzym má tedy 6 podjednotek: β'βα I a α II ωσ (~ 450 kDa).
Eukaryota
Eukaryoty mají více typů jaderných RNAP, z nichž každý je zodpovědný za syntézu odlišné podskupiny RNA. Všechny jsou strukturálně a mechanicky příbuzné jeden druhému a bakteriálnímu RNAP:
- RNA polymeráza I syntetizuje pre- rRNA 45S (35S v kvasinkách), která zraje na rRNA 28S, 18S a 5,8S, které vytvoří hlavní RNA úseky ribozomu .
- RNA polymeráza II syntetizuje prekurzory mRNA a většiny snRNA a mikroRNA . Toto je nejvíce studovaný typ a vzhledem k vysoké úrovni kontroly požadované při transkripci je pro jeho vazbu na promotory zapotřebí řada transkripčních faktorů .
- RNA polymeráza III syntetizuje tRNA , rRNA 5S a další malé RNA nalezené v jádru a cytosolu .
- RNA polymeráza IV syntetizuje siRNA v rostlinách.
- RNA polymeráza V syntetizuje RNA zapojené do tvorby heterochromatinu zaměřené na siRNA v rostlinách.
Eukaryotické chloroplasty obsahují RNAP velmi vysoce podobný bakteriálnímu RNAP („plastidově kódovaná polymeráza, PEP“). Používají sigma faktory zakódované v jaderném genomu.
Chloroplast také obsahuje druhou, strukturálně a mechanicky nesouvisející, jednoduchou podjednotku RNAP („polymeráza kódovaná v jádru, NEP“). Eukaryotické mitochondrie používají POLRMT (lidský), v jádru kódovaný jednojednotkový RNAP. Takové polymery podobné fágům se v rostlinách označují jako RpoT.
Archaea
Archaea má jeden typ RNAP, zodpovědný za syntézu veškeré RNA. Archaeal RNAP je strukturálně a mechanicky podobný bakteriálnímu RNAP a eukaryotickému jadernému RNAP IV a je zvláště úzce strukturně a mechanicky příbuzný s eukaryotickým jaderným RNAP II. Historie objevu archaeal RNA polymerázy je poměrně nedávná. První analýza RNAP archeonu byla provedena v roce 1971, kdy byl izolován a purifikován RNAP z extrémně halofilního Halobacterium cutirubrum . Křišťálové struktury RNAP ze Sulfolobus solfataricus a Sulfolobus shibatae stanovily celkový počet identifikovaných archaealních podjednotek na třináct.
Archaea má podjednotku odpovídající eukaryotickému Rpb1 rozdělenou na dvě. V komplexu S. shibatae neexistuje žádný homolog s eukaryotickým Rpb9 ( POLR2I ) , ačkoli TFS (TFIIS homolog) byl navržen jako homologní na základě podobnosti. Existuje další podjednotka s názvem Rpo13; společně s Rpo5 zaujímá prostor vyplněný inzercí nalezenou v bakteriálních β 'podjednotkách (1 377– 1 420 v Taq ). Dřívější studie o struktuře S. solfataricus s nižším rozlišením nenalezla Rpo13 a pouze přiřadila prostor Rpo5/Rpb5. Rpo3 je pozoruhodný tím, že je proteinem železo -síra . Podjednotka RNAP I/III AC40 nalezená v některých eukaryotech sdílí podobné sekvence, ale neváže železo. Tato doména v obou případech plní strukturální funkci.
Podjednotka Archaeal RNAP dříve používala nomenklaturu „RpoX“, kde je každé podjednotce přiřazeno písmeno způsobem, který nesouvisí s jinými systémy. V roce 2009 byla navržena nová nomenklatura založená na číslování eukaryotické Pol II podjednotky „Rpb“.
Viry
Ortopoxviry a některé další nukleocytoplazmatické velké DNA viry syntetizují RNA pomocí virově kódovaného vícespodjednotkového RNAP. Jsou nejvíce podobné eukaryotickým RNAP, přičemž některé podjednotky jsou zmenšeny nebo odstraněny. Přesně tomu, kterému RNAP jsou nejpodobnější, je téma debaty. Většina ostatních virů, které syntetizují RNA, používá nesouvisející mechaniku.
Mnoho virů používá jednu podjednotku RNAP závislou na DNA (ssRNAP), která je strukturálně a mechanicky příbuzná s jednopodjednotkou RNAP eukaryotických chloroplastů (RpoT) a mitochondrií ( POLRMT ) a vzdáleněji s DNA polymerázami a reverzními transkriptázami . Asi nejrozšířenější studovanou takovou jednou podjednotkou RNAP je bakteriofágová T7 RNA polymeráza . ssRNAPs nemohou provádět korektury.
B. subtilis profage SPβ používá YonO , homolog β+β 'podjednotek msRNAP k vytvoření monomerního (oba sudy na stejném řetězci) RNAP odlišného od obvyklého „pravého“ ssRNAP. Pravděpodobně se velmi dávno lišilo od kanonického pětidílného msRNAP, před dobou posledního univerzálního společného předka .
Jiné viry používají RNAP závislý na RNA (RNAP, který místo DNA využívá RNA jako templát). K tomu dochází u virů RNA s negativním řetězcem a virů dsRNA , oba existují po část svého životního cyklu jako dvouvláknová RNA. Některé viry RNA s pozitivním vláknem , jako je poliovirus , však také obsahují RNAP závislý na RNA.
Dějiny
RNAP byl objeven nezávisle Charles Loe, Audrey Stevens a Jerard Hurwitz v roce 1960. Do této doby, jedna polovina roku 1959 Nobelovu cenu za medicínu byla udělena Severo Ochoa za objev toho, co bylo považováno za RNAP, ale místo toho se obrátil ukázalo být polynukleotid fosforyláza .
Čištění
RNA polymerázu lze izolovat následujícími způsoby:
- U sloupu fosfocelulózovou .
- Tím, glycerol gradientovou centrifugací .
- Sloupcem DNA .
- Sloupcem iontové chromatografie .
A také kombinace výše uvedených technik.
Viz také
Reference
externí odkazy
- DNAi - DNA Interactive, včetně informací a flash klipů na RNA polymerázu.
- RNA+Polymerase v Americké národní knihovně lékařských lékařských oborových nadpisů (MeSH)
- ES 2.7.7.6
- RNA polymeráza - syntéza RNA ze šablony DNA
( Kopie stroje Wayback )
