Fixace (histologie) - Fixation (histology)

V oblasti histologie , patologie a buněčné biologie je fixace ochrana biologických tkání před rozpadem v důsledku autolýzy nebo hniloby . Ukončí všechny probíhající biochemické reakce a může také zvýšit mechanickou pevnost nebo stabilitu ošetřených tkání. Fixace tkáně je kritickým krokem při přípravě histologických řezů, jejím širokým cílem je zachování buněk a složek tkáně a to způsobem, který umožní přípravu tenkých, obarvených řezů. To umožňuje zkoumání struktury tkání, která je dána tvary a velikostmi takových makromolekul (v buňkách a kolem nich), jako jsou proteiny a nukleové kyseliny .

Účely

Při plnění své ochranné úlohy fixátory denaturují proteiny koagulací, tvorbou aditivních sloučenin nebo kombinací koagulačních a aditivních procesů. Sloučenina, která se chemicky přidává k makromolekulám, nejúčinněji stabilizuje strukturu, pokud je schopná kombinovat se s částmi dvou různých makromolekul, což je účinek známý jako zesíťování. Fixace tkáně se provádí z několika důvodů. Jedním z důvodů je zabít tkáň, aby se zabránilo posmrtnému rozpadu (autolýza a hniloba). Fixace zachovává biologický materiál ( tkáň nebo buňky ) co nejblíže svému přirozenému stavu v procesu přípravy tkáně na vyšetření. Aby toho bylo dosaženo, musí být obvykle splněno několik podmínek.

Za prvé, fixátor obvykle působí tak, že deaktivuje vnitřní biomolekuly - zejména proteolytické enzymy - které jinak štěpí nebo poškozují vzorek.

Za druhé, fixační prostředek typicky chrání vzorek před vnějším poškozením. Fixační látky jsou toxické pro většinu běžných mikroorganismů ( zejména bakterií ), které mohou existovat ve vzorku tkáně nebo které by jinak mohly kolonizovat fixovanou tkáň. Navíc mnoho fixátorů chemicky mění fixovaný materiál, aby byl méně chutný (buď nestravitelný nebo toxický) pro oportunní mikroorganismy.

Konečně fixační prostředky často mění buňky nebo tkáně na molekulární úrovni, aby se zvýšila jejich mechanická pevnost nebo stabilita. Tato zvýšená pevnost a tuhost může pomoci zachovat morfologii (tvar a strukturu) vzorku při jeho zpracování pro další analýzu.

I ta nejpečlivější fixace změní vzorek a zavede artefakty, které mohou interferovat s interpretací buněčné ultrastruktury. Významným příkladem je bakteriální mezosom , který byl v 70. letech považován za organelu u grampozitivních bakterií , ale později se ukázalo, že nové techniky vyvinuté pro elektronovou mikroskopii jsou jednoduše artefaktem chemické fixace. Standardizace fixace a dalších postupů zpracování tkání bere v úvahu toto zavedení artefaktů stanovením toho, jaké postupy zavádějí jaké druhy artefaktů. Výzkumníci, kteří vědí, jaké typy artefaktů lze očekávat u každého typu tkáně a techniky zpracování, mohou přesně interpretovat sekce s artefakty nebo zvolit techniky, které minimalizují artefakty v oblastech zájmu.

Proces

Fixace je obvykle první fází vícestupňového procesu přípravy vzorku biologického materiálu pro mikroskopii nebo jinou analýzu. Volba fixačního a fixačního protokolu proto může záviset na plánovaných dalších krocích zpracování a konečných analýzách. Imunohistochemie například používá protilátky, které se vážou na specifický proteinový cíl. Prodloužená fixace může tyto cíle chemicky maskovat a zabránit vazbě protilátky. V těchto případech se obvykle používá metoda „rychlé opravy“ s použitím studeného formalinu po dobu přibližně 24 hodin. K rychlé fixaci lze také použít methanol (100%) a tato doba se může lišit v závislosti na biologickém materiálu. Například lidské buňky rakoviny prsu MDA-MB 231 lze fixovat pouze 3 minuty studeným methanolem (-20 ° C). Pro studie lokalizace enzymů by tkáně měly být buď předem fixovány pouze zlehka, nebo dodatečně fixovány poté, co se vytvořil produkt aktivity enzymu.

Typy

V závislosti na počátečním vzorku existují obecně tři typy fixačních procesů:

Tepelná fixace: Poté, co nátěr zaschne při pokojové teplotě, se sklíčko sevře kleštěmi nebo kolíkem na prádlo a několikrát projde plamenem Bunsenova hořáku, aby zabilo teplo a přilepilo organismus na podložní sklíčko. Rutinně se používá s bakteriemi a archeami. Tepelná fixace obecně zachovává celkovou morfologii, ale ne vnitřní struktury. Teplo denaturuje proteolytický enzym a brání autolýze. Tepelnou fixaci nelze použít v metodě kapsulárního barvení, protože tepelná fixace zmenší nebo zničí kapsli ( glykokalyx ) a není na skvrnách vidět.

Ponoření: Vzorek tkáně je ponořen do fixačního roztoku o objemu minimálně 20krát větším, než je objem tkáně, která má být fixována. Fixátor musí difundovat přes tkáň, aby se fixoval, takže je třeba vzít v úvahu velikost a hustotu tkáně a také typ fixátoru. Toto je běžná technika pro mobilní aplikace. Použití většího vzorku znamená, že fixátoru trvá déle, než se dostane do hlubší tkáně.

Perfúze: Fixace průtokem krve. Fixátor se injektuje do srdce injekčním objemem odpovídajícím srdečnímu výdeji. Fixátor se šíří celým tělem a tkáň nezemře, dokud není fixována. To má tu výhodu, že je zachována dokonalá morfologie, ale nevýhody spočívají v tom, že subjekt zemře a náklady na objem fixačního prostředku potřebného pro větší organismy jsou vysoké.

Chemická fixace

V procesech fixace ponořením i perfuzí se používají chemické fixátory k zachování struktur ve stavu (chemicky i strukturálně) co nejblíže živé tkáni. To vyžaduje chemický fixátor.

Zesíťovací fixační prostředky - aldehydy

Zesíťovací fixátory působí tak, že vytvářejí kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni. To ukotví rozpustné proteiny k cytoskeletu a dodá tkáni další tuhost. Zachování přechodné nebo jemné struktury cytoskeletu, jako jsou kontrakce během embryonálních diferenciačních vln, je nejlépe dosaženo předúpravou pomocí mikrovln před přidáním síťovacího fixátoru.

Nejčastěji používaným fixátorem v histologii je formaldehyd . Obvykle se používá jako 10% neutrální pufrovaný formalin (NBF), tj. 3,7% - 4,0% formaldehydu ve fosfátovém pufru, pH 7. Protože formaldehyd je plyn při pokojové teplotě, používá se při výrobě dřívějšího fixačního prostředku formalin - formaldehydový plyn rozpuštěný ve vodě (~ 37% w/v). Formaldehyd fixuje tkáň zesíťováním proteinů, především zbytků bazické aminokyseliny lysinu . Jeho účinky jsou reverzibilní přebytečnou vodou a vyhýbá se formalinové pigmentaci. Paraformaldehyd se také běžně používá a po zahřátí depolymeruje zpět na formalin, což z něj činí také účinný fixátor. Mezi další výhody paraformaldehydu patří dlouhodobé skladování a dobrá penetrace tkáně. To je zvláště dobré pro imunohistochemické techniky. Pary formaldehydu lze také použít jako fixační prostředek pro stěr buněk.

Dalším oblíbeným aldehydem pro fixaci je glutaraldehyd . Funguje podobně jako formaldehyd, což způsobuje deformaci α-šroubovic proteinů. Glutaraldehyd je však větší molekula než formaldehyd, a tak prostupuje membránami pomaleji. V důsledku toho může být fixace glutaraldehydu na silnějších tkáňových vzorcích obtížná; toto může být problémem snížením velikosti vzorku tkáně. Jednou z výhod fixace glutaraldehydu je, že může nabídnout pevnější nebo pevněji spojený fixovaný produkt - jeho větší délka a dvě aldehydové skupiny mu umožňují „přemostit“ a propojit vzdálenější páry molekul bílkovin. Způsobuje rychlé a nevratné změny, je vhodný pro elektronovou mikroskopii, funguje dobře při 4 ° C a poskytuje nejlepší celkové cytoplazmatické a jaderné detaily. Není to však ideální pro imunohistochemické barvení.

Některé fixační protokoly vyžadují kombinaci formaldehydu a glutaraldehydu, aby se jejich silné stránky navzájem doplňovaly.

Tyto zesíťující fixační prostředky, zejména formaldehyd, mají tendenci k zachování sekundární struktury z proteinů a může také zachovat většinu terciární strukturu .

Srážecí fixátory - alkoholy

Srážecí (nebo denaturační ) fixativy působí snížením rozpustnosti molekul bílkovin a často narušením hydrofobních interakcí, které dávají mnoha proteinům jejich terciární strukturu. Srážení a agregace proteinů je velmi odlišný proces od zesítění, ke kterému dochází s aldehydovými fixačních.

Nejběžnějšími srážecími fixačními činidly jsou ethanol a methanol . Běžně se používají k opravě zamrzlých řezů a šmouh. Používá se také aceton a bylo prokázáno, že produkuje lepší histologickou konzervaci než zmrazené řezy, pokud je použit v technice Aceton Methylbenzoate Xylene (AMEX).

Methanol, ethanol a aceton denaturující proteiny se jen zřídka používají samostatně pro fixaci bloků, pokud nejsou studovány nukleové kyseliny.

Kyselina octová je denaturační prostředek, který se někdy používá v kombinaci s jinými srážecími fixačními prostředky, jako je Davidsonova AFA. Alkoholy samy o sobě jsou známy tím, že způsobují značné smrštění a ztvrdnutí tkáně během fixace, zatímco samotná kyselina octová je spojena s bobtnáním tkáně; kombinace těchto dvou může vést k lepšímu zachování tkáňové morfologie .

Oxidační činidla

Oxidační fixační látky mohou reagovat s postranními řetězci proteinů a dalších biomolekul, což umožňuje tvorbu příčných vazeb, které stabilizují strukturu tkáně. Navzdory zachování jemné buněčné struktury však způsobují rozsáhlou denaturaci a používají se hlavně jako sekundární fixátory.

Oxid osmičelý je často používán jako sekundární fixativ, když jsou vzorky připravené pro elektronovou mikroskopii . (Nepoužívá se pro světelnou mikroskopii, protože velmi špatně proniká do silných částí tkáně.)

Dichroman draselný , kyselina chromová a manganistan draselný nacházejí uplatnění v určitých specifických histologických přípravcích.

Merkuriály

Merkuriály jako B-5 a Zenkerův fixátor mají neznámý mechanismus, který zvyšuje jas barvení a poskytuje vynikající jaderné detaily. Přestože jsou rtuťnaté rychle, špatně pronikají a způsobují smršťování tkáně. Jejich nejlepší aplikace je pro fixaci hematopoetických a retikuloendotelových tkání. Pamatujte také, že jelikož obsahují rtuť, je třeba s likvidací zacházet opatrně.

Picrates

Pikráty dobře pronikají do tkáně, reagují s histony a zásaditými proteiny, vytvářejí krystalické pikráty s aminokyselinami a vysráží všechny proteiny. Je to dobrý fixátor pro pojivové tkáně, dobře uchovává glykogen a extrahuje lipidy, aby poskytoval vynikající výsledky formaldehydu při imunologickém barvení biogenních a polypeptidových hormonů. Způsobuje však ztrátu bazofilů, pokud není vzorek po fixaci důkladně omyt.

NÁDEJ fixátor

Efekt ochrany organického rozpouštědla zprostředkovaný pufrem Hepes-glutamové kyseliny (HOPE) poskytuje morfologii podobnou formalinu, vynikající zachování proteinových antigenů pro imunohistochemii a histochemii enzymů, dobré výtěžky RNA a DNA a nepřítomnost zesíťujících proteinů.

Languages

In other projects