Syntetická genová syntéza - Artificial gene synthesis

Dvojitá šroubovice DNA

Umělá genová syntéza nebo genová syntéza se týká skupiny metod, které se používají v syntetické biologii ke konstrukci a sestavení genů z nukleotidů de novo . Na rozdíl od syntézy DNA v živých buňkách nevyžaduje umělá genová syntéza templátovou DNA, což umožňuje v laboratoři syntetizovat prakticky jakoukoli sekvenci DNA. Obsahuje dva hlavní kroky, z nichž první je syntéza DNA v pevné fázi , někdy známá jako tisk DNA . To produkuje oligonukleotidové fragmenty, které jsou obecně pod 200 párů bází. Druhý krok pak zahrnuje připojení těchto oligonukleotidových fragmentů pomocí různých metod sestavování DNA. Protože umělá genová syntéza nevyžaduje templátovou DNA, je teoreticky možné vyrobit zcela syntetickou molekulu DNA bez omezení nukleotidové sekvence nebo velikosti.

Syntézu prvního kompletního genu, kvasinkové tRNA , demonstroval Har Gobind Khorana a spolupracovníci v roce 1972. Syntéza prvních genů kódujících peptid a protein byla provedena v laboratořích Herberta Boyera a Alexandra Markhama . Nověji byly vyvinuty metody umělé genové syntézy, které umožní sestavení celých chromozomů a genomů. V roce 2014 byl syntetizován první syntetický kvasinkový chromozom a syntetizovány byly také celé funkční bakteriální chromozomy. Kromě toho by umělá syntéza genů mohla v budoucnu využívat nové páry nukleobáz (nepřirozené páry bází).

Standardní metody pro syntézu DNA

Syntéza oligonukleotidů

Oligonukleotidy jsou chemicky syntetizovány pomocí stavebních bloků nazývaných nukleosidové fosforamidity . Mohou to být normální nebo modifikované nukleosidy, které mají chránící skupiny, aby se zabránilo nesprávné interakci jejich aminů, hydroxylových skupin a fosfátových skupin. Naraz se přidá jeden fosforamidit, 5 'hydroxylové skupině se odstraní ochranná skupina a přidá se nová báze a tak dále. Řetěz roste ve směru 3 'až 5', což je zpětně vzhledem k biosyntéze. Nakonec jsou všechny chránící skupiny odstraněny. Jelikož jde o chemický proces, dochází k několika nesprávným interakcím, které vedou k některým vadným výrobkům. Čím delší je syntetizovaná oligonukleotidová sekvence, tím více defektů existuje, takže tento postup je praktický pouze pro produkci krátkých sekvencí nukleotidů . Současný praktický limit je asi 200 bp ( párů bází ) pro oligonukleotid s dostatečnou kvalitou pro použití přímo pro biologickou aplikaci. HPLC lze použít k izolaci produktů se správnou sekvencí. Mezitím lze paralelně syntetizovat velké množství oligo na genových čipech . Pro optimální výkon v následujících postupech syntézy genů by měly být připravovány jednotlivě a ve větších měřítcích.

Spojení oligonukleotidů na bázi žíhání

Obvykle je sada individuálně navržených oligonukleotidů připravena na automatizovaných syntetizátorech na pevné fázi, purifikována a poté spojena specifickým hybridizačním a standardními ligačními nebo polymerázovými reakcemi. Aby se zlepšila specificita hybridizace oligonukleotidů, krok syntézy závisí na sadě enzymů termostabilní DNA ligázy a polymerázy . Dosud bylo popsáno několik způsobů syntézy genů, jako je ligace fosforylovaných překrývajících se oligonukleotidů, metoda Fok I a modifikovaná forma ligázové řetězové reakce pro genovou syntézu. Kromě toho bylo popsáno několik přístupů k sestavení PCR . Obvykle používají oligonukleotidy dlouhé 40 až 50 nukleotidů, které se navzájem překrývají. Tyto oligonukleotidy jsou navrženy tak, aby pokrývaly většinu sekvence obou řetězců, a molekula v plné délce je generována postupně pomocí PCR s překrytím (OE), termodynamicky vyvážené naruby (TBIO) nebo kombinovanými přístupy. Nejčastěji syntetizované geny mají velikost od 600 do 1 200 bp, i když mnohem delší geny byly vytvořeny spojením dříve sestavených fragmentů pod 1 000 bp. V tomto rozmezí velikostí je nutné testovat několik kandidátních klonů potvrzujících sekvenci klonovaného syntetického genu automatizovanými sekvenčními metodami.

Omezení

Navíc, protože sestava kompletního genového produktu závisí na účinném a specifickém uspořádání dlouhých jednovláknových oligonukleotidů, kritické parametry pro úspěch syntézy zahrnují oblasti rozšířené sekvence obsahující sekundární struktury způsobené obrácenými opakováními, mimořádně vysokým nebo nízkým obsahem GC, nebo opakující se struktury. Obvykle lze tyto segmenty konkrétního genu syntetizovat pouze rozdělením postupu do několika po sobě jdoucích kroků a konečným sestavením kratších dílčích sekvencí, což následně vede k významnému prodloužení času a práce potřebné k jeho produkci. Výsledek experimentu genové syntézy silně závisí na kvalitě použitých oligonukleotidů. U těchto protokolů syntézy genů založených na žíhání je kvalita produktu přímo a exponenciálně závislá na správnosti použitých oligonukleotidů. Alternativně po provedení genové syntézy s oligo nižší kvality je třeba vyvinout větší úsilí při zajišťování kvality po proudu během klonové analýzy, která se obvykle provádí časově náročnými standardními postupy klonování a sekvenování. Dalším problémem spojeným se všemi současnými způsoby syntézy genů je vysoká frekvence sekvenčních chyb v důsledku použití chemicky syntetizovaných oligonukleotidů. Frekvence chyb se zvyšuje s delšími oligonukleotidy a v důsledku toho se procento správného produktu dramaticky snižuje, když se používá více oligonukleotidů. Problém mutace by mohl být vyřešen kratšími oligonukleotidy použitými k sestavení genu. Všechny způsoby montáže založené na žíhání však vyžadují smíchání primerů v jedné trubici. V tomto případě kratší překrytí ne vždy umožňuje přesné a specifické žíhání komplementárních primerů, což vede k inhibici tvorby produktu v plné délce. Ruční návrh oligonukleotidů je pracný postup a nezaručuje úspěšnou syntézu požadovaného genu. Pro optimální výkon téměř všech metod založených na žíhání se předpokládá, že teploty tání překrývajících se oblastí jsou podobné pro všechny oligonukleotidy. Nezbytná optimalizace primerů by měla být provedena pomocí specializovaných programů pro návrh oligonukleotidů. Dosud bylo představeno několik řešení pro automatizovaný návrh primerů pro genovou syntézu.

Postupy opravy chyb

K překonání problémů spojených s kvalitou oligonukleotidů bylo vyvinuto několik propracovaných strategií, využívajících buď samostatně připravených rybářských oligonukleotidů, neshodných vazebných enzymů rodiny mutS nebo specifických endonukleáz z bakterií nebo fágů. Nicméně všechny tyto strategie prodlužují čas a náklady na genovou syntézu založenou na hybridizaci chemicky syntetizovaných oligonukleotidů.

Masivně paralelní sekvenování bylo také použito jako nástroj pro screening komplexních oligonukleotidových knihoven a umožnění získání přesných molekul. V jednom přístupu jsou oligonukleotidy sekvenovány na platformě 454 pyrosekvenování a robotický systém snímky a vybírá jednotlivé kuličky odpovídající přesné sekvenci. V jiném přístupu je komplexní knihovna oligonukleotidů modifikována jedinečnými lemujícími značkami před masivně paralelním sekvenováním. Tagově řízené primery pak umožňují získání molekul s požadovanými sekvencemi dial-out PCR.

Geny jsou stále více seřazeny do sad zahrnujících funkčně příbuzné geny nebo varianty více sekvencí na jednom genu. Prakticky všechny vyvíjené terapeutické proteiny, jako jsou monoklonální protilátky, jsou optimalizovány testováním mnoha genových variant na zlepšení funkce nebo exprese.

Nepřirozené páry bází

Zatímco tradiční syntéza nukleových kyselin využívá pouze 4 páry bází - adenin, thymin, guanin a cytosin, syntéza oligonukleotidů by v budoucnu mohla zahrnovat použití nepřirozených párů bází, což jsou uměle navržené a syntetizované nukleobáze, které se v přírodě nevyskytují.

V roce 2012 skupina amerických vědců vedená Floydem Romesbergem, chemickým biologem z Scripps Research Institute v San Diegu v Kalifornii, zveřejnila, že jeho tým navrhl nepřirozený pár bází (UBP). Dva nové umělé nukleotidy neboli Unnatural Base Pair (UBP) byly pojmenovány d5SICS a dNaM . Techničtěji tyto umělé nukleotidy nesoucí hydrofobní nukleobáze obsahují dva kondenzované aromatické kruhy, které v DNA tvoří komplex (d5SICS – dNaM). V roce 2014 stejný tým z Výzkumného ústavu Scripps oznámil, že syntetizovali úsek kruhové DNA známý jako plazmid obsahující přirozené páry bází TA a CG spolu s nejvýkonnější laboratoří UBP Romesberg, kterou navrhla, a vložili ji do buněk společného bakterie E. coli, která úspěšně replikovala nepřirozené páry bází prostřednictvím několika generací. Toto je první známý příklad živého organismu předávajícího rozšířený genetický kód dalším generacím. Toho bylo částečně dosaženo přidáním podpůrného genu řas, který exprimuje transportér nukleotid trifosfátu, který účinně importuje trifosfáty d5SICSTP i dNaMTP do bakterií E. coli . Poté je přirozené cesty bakteriální replikace používají k přesné replikaci plazmidu obsahujícího d5SICS – dNaM.

Úspěšné začlenění třetího páru bází je významným průlomem k cíli výrazně rozšířit počet aminokyselin, které lze kódovat DNA, ze stávajících 20 aminokyselin na teoreticky možných 172, čímž se rozšíří potenciál živých organismů na produkují nové proteiny . V budoucnu by tyto nepřirozené páry bází mohly být syntetizovány a začleněny do oligonukleotidů metodami tisku DNA.

Sestavení DNA

Tisk DNA lze tedy použít k produkci částí DNA, které jsou definovány jako sekvence DNA kódující konkrétní biologickou funkci (například promotory , regulační sekvence transkripce nebo otevřené čtecí rámce ). Protože však syntéza oligonukleotidů typicky nemůže přesně produkovat oligonukleotidové sekvence delší než několik set párů bází, musí být použity metody sestavování DNA k sestavení těchto částí dohromady za účelem vytvoření funkčních genů, vícegenových obvodů nebo dokonce celých syntetických chromozomů nebo genomů. Některé techniky sestavování DNA definují pouze protokoly pro spojování částí DNA, zatímco jiné techniky také definují pravidla pro formát částí DNA, které jsou s nimi kompatibilní. Tyto procesy lze rozšířit tak, aby umožnily sestavení celých chromozomů nebo genomů. V posledních letech došlo k nárůstu počtu různých standardů pro montáž DNA, přičemž od roku 2015 bylo vyvinuto 14 různých standardů montáže, z nichž každý má své klady a zápory. Celkově vývoj standardů sestavování DNA výrazně usnadnil pracovní tok syntetické biologie, napomohl výměně materiálu mezi výzkumnými skupinami a také umožnil vytvoření modulárních a opakovaně použitelných částí DNA.

Různé metody sestavování DNA lze rozdělit do tří hlavních kategorií-sestava zprostředkovaná endonukleázou, místně specifická rekombinace a sestava založená na dlouhém překrývání. Každá skupina metod má své charakteristické vlastnosti a své vlastní výhody a omezení.

Sestava zprostředkovaná endonukleázou

Endonukleázy jsou enzymy, které rozpoznávají a štěpí segmenty nukleových kyselin a lze je použít k usměrnění sestavení DNA. Z různých typů restrikčních enzymů jsou nejběžněji dostupné a používané restrikční enzymy typu II, protože jejich štěpná místa se nacházejí poblíž nebo v jejich rozpoznávacích místech. Metody montáže zprostředkované endonukleázou proto využívají této vlastnosti k definování částí DNA a protokolů sestavování.

BioCihly

Sestava BBF RFC 10 dvou dílů kompatibilních s BioBricks. Ošetření upstream fragmentu pomocí EcoRI a SpeI a downstream fragmentu pomocí EcoRI a XbaI umožňuje sestavení v požadované sekvenci. Protože SpeI a XbaI produkují komplementární přesahy, pomáhají spojit dva fragmenty DNA dohromady a vytvořit sekvenci jizev. Všechna původní restrikční místa jsou zachována v konečném konstruktu, který pak může být použit pro další reakce BioBricks.

Montážní standard BioBricks popsal a představil Tom Knight v roce 2003 a od té doby byl neustále aktualizován. V současné době je nejběžněji používaným standardem BioBricks montážní standard 10 nebo BBF RFC 10. BioBricks definuje sekvence předpon a přípon požadované pro část DNA, aby byla kompatibilní s metodou sestavování BioBricks, což umožňuje spojení všech částí DNA, které jsou ve formátu BioBricks.

Předpona obsahuje restrikční místa pro EcoRI, NotI a XBaI, zatímco přípona obsahuje restrikční místa SpeI, NotI a PstI. Mimo oblasti předpon a přípon nesmí část DNA obsahovat tato restrikční místa. Aby se spojily dvě části BioBrick dohromady, jeden z plazmidů se štěpí EcoRI a SpeI, zatímco druhý plazmid se štěpí EcoRI a Xbal. Dva převisy EcoRI jsou komplementární a budou tedy společně žíhat, zatímco SpeI a XbaI také produkují komplementární převisy, které lze také spojit dohromady. Protože výsledný plazmid obsahuje původní předponové a příponové sekvence, lze jej použít ke spojení s více částmi BioBricks. Kvůli této vlastnosti je montážní standard BioBricks údajně idempotentní . Mezi dvěma fúzovanými BioBricks však bude také vytvořena sekvence „jizvy“ (buď TACTAG nebo TACTAGAG). Tím se zabrání tomu, aby se BioBricks používaly k vytváření fúzních proteinů, protože 6bp jizvová sekvence kóduje tyrosin a stop kodon, což způsobí ukončení translace po expresi první domény, zatímco 8bp jizvová sekvence způsobí posun rámce , což zabrání kontinuálnímu čtení kodony. Aby se nabízely alternativní sekvence jizev, které například způsobí 6bp jizvu, nebo sekvence jizev, které neobsahují stop kodony, byly navrženy další montážní standardy, jako je sestava BB-2, BglBricks Assembly, Silver Assembly a Freiburg Assembly.

Přestože je nejsnadnější způsob montáže dílů BioBrick popsán výše, existuje také několik dalších běžně používaných způsobů montáže, které nabízejí oproti standardní montáži několik výhod. Sestava 3 antibiotik (3A) umožňuje výběr správné sestavy pomocí selekce antibiotik, zatímco sestava amplifikovaného inzertu se snaží překonat nízkou účinnost transformace pozorovanou u sestavy 3A.

Standard sestavení BioBrick také sloužil jako inspirace pro použití jiných typů endonukleáz pro sestavení DNA. Například jak standard iBrick, tak standardy vektorového sestavování HomeRun využívají navádění endonukleáz místo restrikčních enzymů typu II.

Sestava restrikční endonukleázy typu II

Některé způsoby montáže také využívají restrikční endonukleázy typu II. Ty se liší od ostatních endonukleáz typu II, protože odřezávají několik párů bází od rozpoznávacího místa. V důsledku toho může být sekvence převisu upravena tak, aby obsahovala požadovanou sekvenci. To poskytuje montážní metody typu II se dvěma výhodami-umožňuje montáž „bez jizev“ a umožňuje montáž v jedné nádobě a více částí. Metody montáže, které používají endonukleázy typu II, zahrnují Golden Gate a její přidružené varianty.

Klonování Golden Gate
Sekvenci částí DNA pro sestavu Golden Gate lze směrovat definováním unikátních komplementárních přesahů pro každou část. Pro sestavení genu 1 v pořadí fragmentu A, B a C je 3 'převis pro fragment A komplementární k 5' převisu pro fragment B a podobně pro fragment B a fragment C. Pro cílový plazmid je volitelný marker je lemován navenek řezajícími restrikčními místy BsaI. Tím se vybere volitelný marker, což umožní vložení finálního konstruktu. T4 ligáza se používá k ligaci fragmentů dohromady a k cílovému plazmidu.

Sestavovací protokol Golden Gate definovali Engler et al. 2008 definovat metodu sestavení DNA, která by poskytla konečný konstrukt bez sekvence jizvy a zároveň postrádala původní restrikční místa. To umožňuje expresi proteinu, aniž by obsahoval nežádoucí proteinové sekvence, které by mohly negativně ovlivnit skládání nebo expresi proteinu. Použitím restrikčního enzymu BsaI, který produkuje přesah 4 párů párů, lze pro sestavení použít až 240 unikátních nepalindromických sekvencí.

Návrh a montáž plazmidu

Při klonování Golden Gate je každý fragment DNA, který má být sestaven, umístěn do plazmidu, lemovaného dovnitř směřujícími restrikčními místy BsaI obsahujícími naprogramované přesahové sekvence. Pro každý fragment DNA je 3 'přesahová sekvence komplementární k 5' přesahu dalšího downstream fragmentu DNA. U prvního fragmentu je 5 'převis komplementární k 5' přesahu cílového plazmidu, zatímco 3 'přesah konečného fragmentu je komplementární k 3' přesahu cílového plazmidu. Taková konstrukce umožňuje, aby všechny fragmenty DNA byly shromážděny v reakci v jedné nádobě (kde jsou všechny reaktanty smíchány dohromady), přičemž všechny fragmenty jsou uspořádány ve správné sekvenci. Úspěšně sestavené konstrukty jsou vybrány detekováním ztráty funkce screeningové kazety, která byla původně v cílovém plazmidu.

MoClo a Zlatý cop

Původní Golden Gate Assembly umožňuje pouze vytvoření jedné konstrukce v cílovém vektoru. Aby bylo možné tento konstrukt použít v následující reakci jako vstupní vektor, byly navrženy standardy MoClo a Golden Braid.

Standard MoClo zahrnuje definování více úrovní sestavy DNA:

  • Standard montáže MoClo umožňuje, aby byly konstrukce Golden Gate dále sestavovány v následujících úrovních. V tomto příkladu jsou čtyři geny sestavené prostřednictvím sestavy Golden Gate úrovně 1 sestaveny do multi-genového konstruktu v sestavě úrovně 2.
    Standard montáže Golden Braid také navazuje na první úroveň montáže Golden Gate a sestavuje další úrovně pomocí párového protokolu. Čtyři cílové vektory první úrovně (sestavené prostřednictvím sestavy Golden Gate) jsou sestaveny do dvou cílových vektorů úrovně 2, které jsou poté použity jako vstupní vektory úrovně 3 pro cílový vektor úrovně 3. Používají se střídavé restrikční enzymy (BpiI pro úroveň 2 a BsaI pro úroveň 3).
    Montážní standardy MoClo a Golden Braid jsou odvozeny od původního montážního standardu Golden Gate.
    Úroveň 1: Sestava úrovně 1 je standardní sestavou Golden Gate a geny jsou sestaveny z jejich součástí (části DNA kódující genetické prvky, jako jsou UTR , promotory, vazebná místa pro ribozomy nebo sekvence terminátoru ). Hranice inzerčního místa cílových vektorů úrovně 1 jsou dvojicí dovnitř řezajících restrikčních míst BpiI. To umožňuje, aby tyto plasmidy byly použity jako vstupní vektory pro cílové vektory druhé úrovně.
  • Úroveň 2: Sestava úrovně 2 zahrnuje další sestavení genů sestavených v sestavě úrovně 1 do multi-genových konstruktů. Pokud existuje potřeba další sestavy vyšší úrovně, mohou být přidána dovnitř dělící restrikční místa BsaI, která lemují místa vložení. Tyto vektory pak mohou být použity jako vstupní vektory pro konstrukce vyšších úrovní.

Každá montážní úroveň střídá použití restrikčních míst BsaI a BpiI, aby se minimalizoval počet zakázaných míst, a sekvenčního sestavování pro každou vrstvu je dosaženo sledováním návrhu plazmidu Golden Gate. Celkově standard MoClo umožňuje sestavení konstruktu, který obsahuje více transkripčních jednotek, všechny sestavené z různých částí DNA, sérií reakcí Golden Gate v jednom hrnci. Jednou nevýhodou standardu MoClo je však to, že vyžaduje použití „figurín“ bez biologické funkce, pokud konečný konstrukt vyžaduje méně než čtyři součásti. Standard Golden Braid na druhé straně zavedl párový standard montáže Golden Gate.

Standard Golden Braid používá stejnou víceúrovňovou sestavu jako MoClo, ale každá úroveň zahrnuje pouze sestavení dvou fragmentů DNA, tj. Párový přístup. V každé vrstvě jsou tedy páry genů klonovány do cílového fragmentu v požadované sekvenci a ty jsou následně sestaveny po dvou v postupných vrstvách. Stejně jako MoClo standard Golden Braid střídá restrikční enzymy BsaI a BpiI mezi každou úrovní.

Vývoj metod montáže Golden Gate a jejích variant umožnil výzkumníkům navrhnout sady nástrojů pro urychlení pracovního postupu syntetické biologie. Například EcoFlex byl vyvinut jako sada nástrojů pro E. Coli, která pro své části DNA používá standard MoClo, a podobný soubor nástrojů byl také vyvinut pro konstrukci Chlamydomonas reinhardtii mircoalgae.

Site-specific recombination

Vstupní klony Gateway Cloning musí být nejprve vytvořeny pomocí syntetizovaného fragmentu DNA obsahujícího požadovaná místa attB. Rekombinace s donorovým vektorem je katalyzována směsí BP klonázy a vytváří požadovaný vstupní vektor s místy attL.
Požadovaný konstrukt se získá rekombinací vstupního vektoru s cílovým vektorem. V tomto případě konečný konstrukt zahrnuje sestavení dvou požadovaných fragmentů DNA. Místa attL na vstupním vektoru rekombinují s místy attR na cílovém vektoru. Smrtelný gen ccdB je ztracen z cílového vektoru a jakékoli bakterie, které absorbují nežádoucí vektor, zemřou, což umožňuje výběr požadovaného vektoru.
Objev ortogonálních att lokalit, které jsou specifické (tj. Každý ortogonální attL reaguje pouze se svým partnerským attR), umožnil vývoj technologie Multisite Gateway Cloning. To umožňuje sestavení více fragmentů DNA, přičemž pořadí sestavení je určeno místy att.
Shrnutí klíčových technologií klonování brány.

Místně specifická rekombinace využívá fágové integrázy místo restrikčních enzymů, což eliminuje potřebu mít restrikční místa ve fragmentech DNA. Integráty místo toho využívají jedinečná místa připojení (att) a katalyzují přeskupení DNA mezi cílovým fragmentem a cílovým vektorem. Klonovací systém Invitrogen Gateway byl vynalezen na konci 90. let minulého století a využívá dvě patentované směsi enzymů, BP klonázu a LR klonázu. Směs BP klonázy katalyzuje rekombinaci mezi místy attB a attP a vytváří hybridní místa attL a attR, zatímco směs LR klonázy katalyzuje rekombinaci míst attL a attR za vzniku míst attB a attP. Protože každá směs enzymů rozpoznává pouze specifická att místa, je rekombinace vysoce specifická a fragmenty lze sestavit v požadované sekvenci.

Vektorový design a montáž

Protože klonování brány je patentovaná technologie, musí být všechny reakce brány prováděny pomocí sady Gateway, kterou poskytuje výrobce. Reakci lze shrnout do dvou kroků. První krok zahrnuje sestavení vstupních klonů obsahujících požadovaný fragment DNA, zatímco druhý krok zahrnuje vložení tohoto požadovaného fragmentu do cílového klonu.

  1. Vstupní klony musí být vytvořeny pomocí dodaných vektorů "Donor" obsahujících Gateway kazetu lemovanou místy attP. Kazeta Gateway obsahuje gen bakteriální sebevraždy (např. CcdB ), který umožní přežití a selekci úspěšně rekombinovaných vstupních klonů. Dvojice míst attB se přidá k boku požadovaného fragmentu DNA, což umožní rekombinaci s místy attP, když se přidá směs BP klonázy. Produkují se vstupní klony a požadovaný fragment je lemován místy attL.
  2. Cílový vektor je dodáván také s kazetou Gateway, ale místo toho je lemován dvojicí webů attR. Smíchání tohoto cílového plazmidu se vstupními klony a směsí LR klonázy umožní rekombinaci mezi místy attR a attL. Vytvoří se cílový klon, přičemž požadovaný fragment byl úspěšně vložen. Smrtelný gen je vložen do původního vektoru a bakterie transformované tímto plazmidem zemřou. Požadovaný vektor tak lze snadno vybrat.

Nejranější iterace metody klonování brány umožňovala použít pouze jeden vstupní klon pro každý vyrobený cílový klon. Další výzkum však odhalil, že lze generovat další čtyři ortogonální sekvence att, což umožňuje sestavení až čtyř různých fragmentů DNA, a tento proces je nyní známý jako technologie Multisite Gateway.

Kromě klonování Gateway byly vyvinuty i nekomerční metody využívající jiné integrázy. Například metoda SIRA (Serine Integrase Recombinational Assembly) používá integrázu ϕC31, zatímco metoda Tandem Assembly-Site-Specific Recombination-based Tandem Assembly (SSRTA) využívá integrázu fága Streptomyces φBT1. Jiné metody, jako například HomeRun Vector Assembly System (HVAS), staví na klonovacím systému Gateway a dále začleňují naváděcí endouleasy k návrhu protokolu, který by potenciálně mohl podporovat průmyslovou syntézu syntetických DNA konstruktů.

Metody montáže založené na dlouhém překrytí vyžadují přítomnost dlouhých překrývajících se oblastí na částech DNA, které mají být sestaveny. To umožňuje konstrukci komplementárních převisů, které se mohou žíhat komplementárním párováním bází. Existuje celá řada metod, např. Gibson Assembly, CPEC, MODAL, které využívají tohoto konceptu k sestavení DNA.

Sestava založená na dlouhém překrytí

V posledních letech byla vyvinuta řada montážních metod založených na dlouhém překrývání. Jedna z nejčastěji používaných metod, Gibsonova montážní metoda, byla vyvinuta v roce 2009 a poskytuje metodu sestavení DNA v jedné nádobě, která nevyžaduje použití restrikčních enzymů nebo integráz. Mezi další podobné způsoby montáže založené na překrývání patří Circle Polymerase Extension Cloning (CPEC), Sequence and Ligase Independent Cloning (SLIC) a Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE). Navzdory přítomnosti mnoha překrývajících se montážních metod je stále nejpopulárnější způsob montáže Gibson. Kromě výše uvedených metod stavěli další výzkumníci na konceptech použitých při montáži Gibson a dalších metodách montáže při vývoji nových montážních strategií, jako je strategie MODAL (Modular Overlap-Directed Assembly with Linkers) nebo Biopart Assembly Standard pro Idempotent Cloning (BASIC) ) metoda.

Gibsonova montáž

Gibsonova montážní metoda je relativně jednoduchá metoda sestavování DNA, která vyžaduje pouze několik dalších reagencií: 5 'T5 exonukleázu , Phusion DNA polymerázu a Taq DNA ligázu . Fragmenty DNA, které mají být sestaveny, jsou syntetizovány tak, aby měly překrývající se konce 5 'a 3' v pořadí, ve kterém mají být sestaveny. Tato činidla jsou smíchána s fragmenty DNA, které mají být sestaveny, při 50 ° C a dochází k následujícím reakcím:

  1. Exonukleáza T5 žvýká zpět DNA z 5 'konce každého fragmentu a na každém fragmentu DNA vystavuje 3' přesahy.
  2. Komplementární přesahy na sousedních fragmentech DNA hybridizují pomocí komplementárního párování bází.
  3. Fúzní DNA polymeráza vyplňuje mezery, kde fragmenty žíhají.
  4. Taq DNA ligáza opravuje zářezy na obou řetězcích DNA.

Protože je exonukleáza T5 tepelně labilní, je po počátečním kroku žvýkání inaktivována při 50 ° C. Produkt je tedy stabilní a fragmenty jsou sestaveny v požadovaném pořadí. Tento protokol v jedné nádobě dokáže přesně sestavit až 5 různých fragmentů, zatímco několik komerčních poskytovatelů má sady pro přesné sestavení až 15 různých fragmentů ve dvoustupňové reakci. Přestože je Gibsonův montážní protokol rychlý a používá relativně málo reagencií, vyžaduje syntézu DNA na míru, protože každý fragment musí být navržen tak, aby obsahoval překrývající se sekvence se sousedními fragmenty a amplifikován pomocí PCR. Tato závislost na PCR může také ovlivnit věrnost reakce, pokud jsou použity dlouhé fragmenty, fragmenty s vysokým obsahem GC nebo opakující se sekvence.

Standard MODAL poskytuje společný formát, který umožňuje kompatibilitu jakékoli části DNA s Gibsonovým sestavením nebo jinými metodami překrývání. Daný fragment DNA prochází dvěma koly PCR, nejprve k připojení předpony a přípon adaptéru a poté k připojení předem definovaných sekvencí linkeru. Jakmile jsou díly v požadovaném formátu, lze provádět způsoby montáže, jako je montáž Gibson. Pořadí částí je řízeno linkery, tj. Stejná sekvence linkeru je připojena k 3 'konci upstream části a 5' konci downstream části.

MODÁLNÍ

Strategie MODAL definuje překrývající se sekvence známé jako „linkery“, aby se snížilo množství přizpůsobení, které je třeba provést s každým fragmentem DNA. Linkery byly navrženy pomocí softwaru R2oDNA Designer a překrývající se oblasti byly navrženy tak, aby byly dlouhé 45 bp, aby byly kompatibilní s Gibsonovým sestavením a dalšími metodami překrývání. K připojení těchto linkerů k sestavovaným částem se PCR provádí pomocí částečně specifických primerů obsahujících 15 bp předponové a příponové sekvence adaptéru. Linkery jsou potom připojeny k sekvencím adaptéru druhou reakcí PCR. Pro umístění fragmentů DNA bude stejný linker připojen k příponě požadovaného upstream fragmentu a předponě požadovaných downstream fragmentů. Jakmile jsou linkery připojeny, lze pro sestavení fragmentů DNA v požadovaném pořadí použít sestavu Gibson, CPEC nebo jiné způsoby překrývání.

ZÁKLADNÍ

Strategie montáže BASIC byla vyvinuta v roce 2015 a snažila se řešit omezení dřívějších montážních technik a začlenila z nich šest klíčových konceptů: standardní opakovaně použitelné díly; jednostupňový formát (všechny díly jsou ve stejném formátu a jsou sestaveny stejným postupem); idempotentní klonování; paralelní (vícedílná) sestava DNA; nezávislost na velikosti; automatizovatelnost.

Části DNA a design linkeru

Části DNA jsou navrženy a klonovány do skladovacích plazmidů, přičemž část je lemována integrovanou předponou ( i P) a integrovanou příponou ( i S). Sekvence i P a i S obsahují dovnitř obrácená restrikční místa BsaI, která obsahují přesahy komplementární k BASIC linkerům. Stejně jako v MODALu bylo 7 standardních linkerů použitých v BASIC navrženo pomocí softwaru R2oDNA Designer a prověřeno, aby bylo zajištěno, že neobsahují sekvence s homologií s genomy podvozku a že neobsahují nežádoucí sekvence, jako jsou sekvence sekundární struktury, restrikční místa nebo ribozomální vazebná místa. Každá sekvence linkeru je rozdělena na dvě poloviny, každou s přesahem 4 bp komplementární k restrikčnímu místu BsaI, dvouvláknovou sekvenci 12 bp a sdílející překryvnou sekvenci 21 bp s druhou polovinou. Polovina, která se bude vázat na upstream část DNA, je známá jako příponová linkerová část (např. L1S) a polovina, která se váže na downstream část, je známá jako prefixová linkerová část (např. L1P). Tyto linkery tvoří základ pro sestavení částí DNA dohromady.

Kromě směrování pořadí montáže lze standardní linkery BASIC také upravit tak, aby vykonávaly další funkce. Aby byla umožněna idempotentní montáž, byly také navrženy linkery s dalšími methylovanými sekvencemi i P a i S, které byly vloženy, aby byly chráněny před rozpoznáváním BsaI. Tato methylace je ztracena po transformaci a replikaci plazmidu in vivo a plazmidy mohou být extrahovány, purifikovány a použity pro další reakce.

Protože sekvence linkeru jsou relativně dlouhé (45 bp pro standardní linker), existuje příležitost začlenit funkční sekvence DNA, aby se snížil počet částí DNA potřebných během sestavování. BASIC montážní standard poskytuje několik linkerů s RBS různých sil. Podobně, aby se usnadnila konstrukce fúzních proteinů obsahujících více proteinových domén, bylo také navrženo několik fúzních linkerů, aby bylo umožněno úplné přečtení DNA konstruktu. Tyto fúzní linkery kódují 15 aminokyselinový glycinový a serinový polypeptid, což je ideální linkerový peptid pro fúzní proteiny s více doménami.

Části DNA, které mají být použity pro sestavení BASIC, musí obsahovat integrované sekvence předpon a přípon (iP a iS). Ty obsahují restrikční místa BsaI, která umožní připojení linkerů iP a iS (které obsahují komplementární přesahové sekvence) k části DNA. Jakmile jsou spojovací prvky připojeny, je díl připraven k montáži.
Sekvence montáže je řízena umístěním linkerů. Příponový linker je ligován na 3 'konec upstream fragmentu, zatímco prefixový linker je ligován na 5' konec downstream fragmentu. Zde je ukázán příklad základní sestavy sestavy využívající čtyři části DNA.

Shromáždění

Při sestavování finální konstrukce existují tři hlavní kroky.

  1. Nejprve se části DNA vyříznou ze skladovacího plazmidu, čímž se získá fragment DNA s přesahy BsaI na 3 'a 5' konci.
  2. Dále je každá část linkeru připojena k příslušné části DNA inkubací s T4 DNA ligázou. Každá část DNA bude mít příponu a prefix spojovací část ze dvou různých linkerů, které budou řídit pořadí sestavení. Například první část v sekvenci bude mít L1P a L2S, zatímco druhá část bude mít připojené L2P a L3S. Díly linkeru lze změnit, aby se změnil sled montáže.
  3. Nakonec se části s připojenými linkery spojí do plazmidu inkubací při 50 ° C. 21 bp přesahy P a S linkerů hybridizují a konečný konstrukt může být transformován do bakteriálních buněk pro klonování. Jednovláknové zářezy jsou opraveny in vivo po transformaci za vzniku stabilního konečného konstruktu klonovaného do plazmidů.

Aplikace

Protože metody tisku DNA a montáže DNA umožnily v posledních letech postupné a exponenciální zlevnění komerční genové syntézy, představuje umělá genová syntéza účinný a flexibilní inženýrský nástroj pro vytváření a navrhování nových sekvencí DNA a proteinových funkcí. Kromě syntetické biologie by různým oblastem výzkumu, jako jsou ty, které zahrnují expresi heterologních genů , vývoj vakcín , genovou terapii a molekulární inženýrství, výrazně pomohlo mít rychlé a levné metody pro syntézu DNA pro kódování proteinů a peptidů. Metody používané pro tisk a montáž DNA dokonce umožnily použití DNA jako média pro ukládání informací .

Syntéza bakteriálních genomů

Laboratoř Synthia a Mycoplasma

28. června 2007 publikoval tým z Institutu J. Craiga Ventera článek ve Science Express s tím, že úspěšně transplantovali přirozenou DNA z bakterie Mycoplasma mycoides do buňky Mycoplasma capricolum , čímž vznikla bakterie, která se chovala jako M . mycoides .

On Oct 6, 2007, Craig Venter oznámil v rozhovoru pro britské The Guardian noviny, že stejný tým syntetizoval upravenou verzi jediného chromozómu z Mycoplasma genitalium uměle. Chromozom byl upraven tak, aby eliminoval všechny geny, které testy na živých bakteriích se ukázaly být zbytečné. Dalším plánovaným krokem v tomto projektu minimálního genomu je transplantace syntetizovaného minimálního genomu do bakteriální buňky s odstraněnou starou DNA; výsledná bakterie se bude jmenovat Mycoplasma laboratorium . Druhý den kanadská skupina pro bioetiku ETC Group vydala prostřednictvím svého zástupce Pat Mooneyho prohlášení, že Venter's „výtvor“ byl „podvozek, na kterém se dalo postavit téměř cokoli“. Syntetizovaný genom ještě nebyl transplantován do fungující buňky.

21. května 2010 věda uvedla, že skupina Venter úspěšně syntetizovala genom bakterie Mycoplasma mycoides z počítačového záznamu a syntetizovaný genom transplantovala do stávající buňky bakterie Mycoplasma capricolum , které odstranila DNA. „Syntetická“ bakterie byla životaschopná, tj. Schopná se replikovat miliardykrát. Tým původně plánoval použít bakterii M. genitalium, se kterou dříve pracovali, ale přešel na M. mycoides, protože druhá bakterie roste mnohem rychleji, což se promítlo do rychlejších experimentů. Venter to popisuje jako „první druh .... aby jeho rodiče byli počítač“. Transformovaná bakterie je ETC přezdívaná " Synthia ". Mluvčí společnosti Venter v době psaní tohoto článku odmítl potvrdit jakýkoli průlom.

Syntetické kvasnice 2.0

V rámci projektu Synthetic Yeast 2.0 se různé výzkumné skupiny po celém světě účastnily projektu syntézy syntetických genomů kvasinek a prostřednictvím tohoto procesu optimalizovaly genom modelového organismu Saccharomyces cerevisae . Projekt Yeast 2.0 použil různé metody montáže DNA, které byly diskutovány výše, a v březnu 2014 Jef Boeke z Langone Medical Center na New York University odhalil, že jeho tým syntetizoval chromozom III S. cerevisae . Procedura zahrnovala nahrazení genů v původním chromozomu syntetickými verzemi a hotový syntetický chromozom byl poté integrován do kvasinkové buňky. Vyžadovalo to navrhnout a vytvořit 273 871 párů bází DNA - méně než 316 667 párů v původním chromozomu. V březnu 2017 byla syntéza 6 ze 16 chromozomů dokončena, přičemž syntéza ostatních stále probíhá.

Viz také

Poznámky