Afinitní chromatografie - Affinity chromatography

Afinitní chromatografie je metoda separace biomolekuly ze směsi na základě vysoce specifické interakce makromolekulární vazby mezi biomolekulou a jinou látkou. Specifický typ vazebné interakce závisí na požadované biomolekule; interakce antigen a protilátka , enzym a substrát , receptor a ligand nebo protein a nukleová kyselina jsou často využívány k izolaci různých biomolekul. Ve srovnání s jinými chromatografickými metodami je afinitní chromatografie užitečná pro svou vysokou selektivitu a rozlišení separace.

Zásada

Afinitní chromatografie využívá specifických vazebných interakcí mezi sledovaným analytem (normálně rozpuštěným v mobilní fázi ) a vazebným partnerem nebo ligandem (imobilizovaným na stacionární fázi ). V typickém experimentu s afinitní chromatografií je ligand připojen k pevné nerozpustné matrici-obvykle polymeru, jako je agaróza nebo polyakrylamid- chemicky upravený tak, aby zavedl reaktivní funkční skupiny, se kterými může ligand reagovat, za vzniku stabilních kovalentních vazeb. Stacionární fáze se nejprve načte do kolony, do které se zavede mobilní fáze. Molekuly, které se vážou na ligand, zůstanou spojeny se stacionární fází. Poté se aplikuje promývací pufr, aby se odstranily necílové biomolekuly narušením jejich slabších interakcí se stacionární fází, zatímco sledované biomolekuly zůstanou navázané. Cílové biomolekuly pak mohou být odstraněny aplikací takzvaného elučního pufru, který narušuje interakce mezi navázanými cílovými biomolekulami a ligandem. Cílová molekula se tak izoluje v elučním roztoku.

Afinitní chromatografie nevyžaduje, aby byla známa molekulová hmotnost, náboj, hydrofobicita nebo jiné fyzikální vlastnosti sledovaného analytu, přestože znalost jeho vazebných vlastností je užitečná při navrhování separačního protokolu. Typy vazebných interakcí běžně využívaných při postupech afinitní chromatografie jsou shrnuty v následující tabulce.

Typické biologické interakce používané v afinitní chromatografii
St. Č Druhy ligandů Cílová molekula
1 Analogový substrát Enzymy
2 Protilátka Antigen
3 Lektin Polysacharid
4 Nukleová kyselina Komplementární sekvence bází
5 Hormon Receptor
6 Avidin Biotin/Biotin-konjugovaná molekula
7 Kalmodulin Vazebný partner kalmodulinu
8 Glutathion GST fúzní protein
9 Bílkoviny A a G Imunoglobuliny
10 Kovové ionty Polyhistidinový fúzní protein

Nastavení dávek a sloupců

Sloupcová chromatografie
Dávková chromatografie

Vazby na pevnou fázi lze dosáhnout sloupcovou chromatografií, kdy se pevné médium naplní na kolonu, počáteční směs prochází kolonou, aby se umožnilo usazení, promývací pufr prochází kolonou a eluční pufr se následně nanese na kolonu a sebere se . Tyto kroky se obvykle provádějí při okolním tlaku. Alternativně lze vazby dosáhnout použitím vsádkového zpracování, například přidáním počáteční směsi k pevné fázi v nádobě, mícháním, oddělením pevné fáze, odstraněním kapalné fáze, promytím, opětovným odstředěním, přidáním elučního pufru, znovu odstředit a vyjmout eluát.

Někdy se používá hybridní metoda tak, že se vazba provádí vsádkovým způsobem, ale pevná fáze s navázanou cílovou molekulou se nanese na kolonu a na koloně se provede promytí a eluce.

Ligandy používané v afinitní chromatografii se získávají z organických i anorganických zdrojů. Příklady biologických zdrojů jsou sérové ​​proteiny, lektiny a protilátky. Anorganické zdroje jako moronické akty, cheláty kovů a triazinová barviva.

Byla také vyvinuta třetí metoda, absorpce expandovaného lože, která kombinuje výhody obou výše uvedených metod. Částice pevné fáze jsou umístěny do kolony, kde je kapalná fáze čerpána ze dna a vystupuje nahoře. Gravitace částic zajišťuje, že pevná fáze neopouští kolonu s kapalnou fází.

Afinitní kolony lze eluovat změnou koncentrací solí, pH, pl, náboje a iontové síly přímo nebo pomocí gradientu za účelem vyřešení požadovaných částic.

V poslední době byla vyvinuta nastavení využívající více než jeden sloupec v sérii. Výhodou ve srovnání s nastavením jedné kolony je, že pryskyřičný materiál lze plně naplnit, protože nevázaný produkt je přímo předáván do po sobě jdoucí kolony s čerstvým materiálem kolony. Tyto chromatografické postupy jsou známé jako periodická protiproudá chromatografie (PCC). Náklady na pryskyřici na množství vyrobeného produktu lze tak drasticky snížit. Protože jeden sloupec lze vždy eluovat a regenerovat, zatímco je načten druhý sloupec, jsou již dva sloupce dostačující k plnému využití výhod. Další kolony mohou poskytnout dodatečnou flexibilitu pro časy eluce a regenerace za cenu dalšího vybavení a nákladů na pryskyřici.

Specifické použití

Afinitní chromatografii lze použít v řadě aplikací, včetně čištění nukleových kyselin, čištění proteinů z bezbuněčných extraktů a čištění z krve.

Použitím afinitní chromatografie lze oddělit proteiny, které se vážou k určitému fragmentu, od proteinů, které tento specifický fragment neváže. Protože tato technika čištění závisí na biologických vlastnostech potřebného proteinu, je to užitečná technika a proteiny lze purifikovat v mnoha krocích v jednom kroku.

Různá afinitní média

Existuje mnoho různých afinitních médií pro různá možná použití. Stručně řečeno, jsou (zobecněné) aktivovány/funkcionalizovány, které fungují jako funkční mezikus, podpůrná matice a eliminuje manipulaci s toxickými činidly.

Aminokyselinová média se používají s řadou sérových proteinů, proteinů, peptidů a enzymů, stejně jako rRNA a dsDNA. Avidinová biotinová média se používají v procesu čištění biotinu/avidinu a jejich derivátů.

Vazba sacharidů se nejčastěji používá s glykoproteiny nebo jakoukoli jinou látkou obsahující uhlovodany; uhlohydrát se používá s lektiny, glykoproteiny nebo jakýmkoli jiným proteinem metabolitu uhlohydrátů. Médium barviva ligandu je nespecifické, ale napodobuje biologické substráty a proteiny. Glutathion je užitečný pro separaci GST značených rekombinantních proteinů. Heparin je generalizovaný afinitní ligand a je nejužitečnější pro separaci plazmatických koagulačních proteinů spolu s enzymy nukleových kyselin a lipázami

K cílení volných karboxylových skupin a proteinů se nejčastěji používají hydrofobní interakční média.

Imunoafinitní média (podrobně popsaná níže) využívají k oddělení vysokou specifitu antigenů a protilátek; afinitní chromatografie s imobilizovaným kovem je podrobně popsána níže a k oddělení využívá interakce mezi kovovými ionty a proteiny (obvykle speciálně označenými); nukleotid/koenzym, který funguje k oddělení dehydrogenáz, kináz a transamináz.

Nukleové kyseliny fungují tak, že zachycují mRNA, DNA, rRNA a další nukleové kyseliny/oligonukleotidy. K čištění imunoglobulinů se používá metoda protein A/G.

Speciální média jsou určena pro konkrétní třídu nebo typ enzymu protein/co; tento typ média bude fungovat pouze k oddělení konkrétního proteinu nebo koenzymu.

Imunoafinita

Dalším použitím postupu je afinitní čištění protilátek z krevního séra. Pokud je známo, že sérum obsahuje protilátky proti specifickému antigenu (například pokud sérum pochází z organismu imunizovaného proti příslušnému antigenu), pak jej lze použít k afinitní purifikaci tohoto antigenu. Toto je také známé jako imunoafinitní chromatografie. Například pokud je organismus imunizován proti GST-fúznímu proteinu, bude produkovat protilátky proti fúznímu proteinu a případně také protilátky proti GST tagu. Protein pak může být kovalentně spojen s pevným podkladem, jako je agaróza, a použit jako afinitní ligand při purifikaci protilátky z imunitního séra.

Pro důkladnost lze protein GST a fúzní protein GST spojit každý zvlášť. Sérum se zpočátku nechá vázat na GST afinitní matrici. Tím se odstraní protilátky proti GST části fúzního proteinu. Sérum se poté oddělí od pevného nosiče a nechá se vázat na matrici GST-fúzního proteinu. To umožňuje zachytit jakékoli protilátky, které rozpoznávají antigen, na pevném nosiči. Eluce požadovaných protilátek se nejčastěji dosahuje použitím pufru s nízkým pH, jako je glycin pH 2,8. Eluát se shromáždí do neutrálního tris nebo fosfátového pufru, aby se neutralizoval eluční pufr s nízkým pH a zastavila jakákoli degradace aktivity protilátky. Toto je pěkný příklad, protože afinitní čištění se používá k čištění počátečního GST-fúzního proteinu, k odstranění nežádoucích anti-GST protilátek ze séra a k čištění cílové protilátky.

Monoklonální protilátky mohou být také vybrány tak, aby vážily proteiny s velkou specificitou, kde se protein uvolňuje za poměrně jemných podmínek. To může být užitečné pro další výzkum v budoucnosti.

K purifikaci protilátek generovaných proti peptidovým antigenům se často používá zjednodušená strategie . Když jsou peptidové antigeny produkovány synteticky, je přidán koncový cysteinový zbytek buď na N- nebo C-konec peptidu. Tento cysteinový zbytek obsahuje sulfhydrylovou funkční skupinu, která umožňuje peptid snadno konjugovat s nosným proteinem (např. Keyhole limpet hemocyanin (KLH)). Stejný peptid obsahující cystein je také imobilizován na agarosovou pryskyřici přes cysteinový zbytek a poté je použit k čištění protilátky.

Většina monoklonálních protilátek byla purifikována pomocí afinitní chromatografie na základě imunoglobulinu specifického proteinu A nebo proteinu G , odvozeného z bakterií.

Imunoafinitní chromatografie s monoklonálními protilátkami imobilizovanými na monolitické koloně byla úspěšně použita k zachycení extracelulárních váčků (např. Exozomů a exomerů) z lidské krevní plazmy zaměřením na tetraspaniny a integriny nalezené na povrchu EV.

Imunoafinitní chromatografie je také základem pro proužky imunochromatografických testů (ICT), které poskytují rychlý způsob diagnostiky v péči o pacienta. Pomocí ICT může technik provést stanovení u lůžka pacienta, aniž by potřeboval laboratoř. Detekce ICT je vysoce specifická pro mikroby způsobující infekci.

Afinitní chromatografie s imobilizovanými kovovými ionty

Imobilizovaná kovová iontová afinitní chromatografie (IMAC) je založena na specifické souřadnicové kovalentní vazbě aminokyselin, zejména histidinu, na kovy. Tato technika funguje tak, že umožňuje, aby proteiny s afinitou k kovovým iontům byly zadrženy ve sloupci obsahujícím imobilizované kovové ionty, jako je kobalt, nikl nebo měď, pro čištění proteinů nebo peptidů obsahujících histidin, železa, zinku nebo galia pro čištění fosforylovaných proteinů nebo peptidů. Mnoho přirozeně se vyskytujících proteinů nemá afinitu k kovovým iontům, proto lze k zavedení takového proteinového tagu do příslušného genu použít technologii rekombinantní DNA . Metody používané k eluci požadovaného proteinu zahrnují změnu pH nebo přidání kompetitivní molekuly, jako je imidazol .

Chromatografická kolona obsahující kuličky nikl-agarosy používaná k čištění proteinů s histidinovými značkami

Rekombinantní proteiny

Možná nejběžnější použití afinitní chromatografie je pro čištění rekombinantních proteinů. Proteiny se známou afinitou jsou označeny proteiny, aby se usnadnilo jejich čištění. Protein mohl být geneticky modifikován tak, aby mohl být vybrán pro afinitní vazbu; toto je známé jako fúzní protein. Mezi značky patří hexahistidin ( His ), glutathion -S -transferáza ( GST) a protein vázající maltózu (MBP). Histidinové značky mají afinitu k iontům niklu , kobaltu , zinku , mědi a železa, které byly imobilizovány vytvořením souřadnicových kovalentních vazeb s chelátorem zabudovaným ve stacionární fázi. K eluci se použije nadbytečné množství sloučeniny schopné působit jako ligand kovových iontů, jako je imidazol . GST má afinitu ke glutathionu, který je komerčně dostupný imobilizovaný jako glutathion agaróza. Během eluce se přebytek glutathionu používá k vytlačení značeného proteinu.

Lektiny

Lektinová afinitní chromatografie je forma afinitní chromatografie, kde se lektiny používají k oddělení složek ve vzorku. Lektiny, jako je concanavalin A, jsou proteiny, které mohou vázat specifické molekuly alfa-D-mannózy a alfa-D-glukosy. Některé běžné molekuly sacharidů, které se používají v afinitní chromatografii s lektinem, jsou Con A-Sepharose a WGA-agarose. Dalším příkladem lektinu je aglutinin z pšeničných klíčků, který váže DN-acetyl-glukosamin. Nejběžnější aplikací je oddělení glykoproteinů od neglykosylovaných proteinů nebo jedné glykoformy od jiné glykoformy. Ačkoli existují různé způsoby provádění afinitní chromatografie s lektinem, cílem je extrahovat cukerný ligand požadovaného proteinu.

Specialita

Dalším použitím pro afinitní chromatografii je čištění specifických proteinů pomocí gelové matrice, která je pro konkrétní protein jedinečná. Například purifikace p-galaktosidázy E. coli se provádí afinitní chromatografií s použitím p-aminobenyl-1-thio-p-D-galaktopyranosyl agarózy jako afinitní matrice. Jako afinitní matrice se používá p-aminobenyl-1-thio-p-D-galaktopyranosyl agaróza, protože obsahuje galaktopyranosylovou skupinu, která slouží jako dobrý substrátový analog pro E. coli-B-galaktosidázu. Tato vlastnost umožňuje enzymu vázat se na stacionární fázi afinitní matrice a je eluován přidáním zvyšujících se koncentrací soli do kolony.

Alkalická fosfatáza

Alkalickou fosfatázu z E. coli lze purifikovat pomocí DEAE-celulózové matrice. A. fosfatáza má mírně záporný náboj, což jí umožňuje slabě se vázat na kladně nabité aminové skupiny v matrici. Enzym pak může být eluován přidáním pufru s vyšší koncentrací solí.

Boronátová afinitní chromatografie

Boronátová afinitní chromatografie spočívá v použití kyseliny borité nebo boronátů k eluci a kvantifikaci množství glykoproteinů . Klinické adaptace použily tento typ chromatografie pro použití při stanovení dlouhodobého hodnocení diabetických pacientů prostřednictvím analýzy jejich glykovaného hemoglobinu .

Purifikace sérového albuminu

Z mnoha použití afinitní chromatografie je jedno její použití vidět v afinitní purifikaci kontaminace albuminu a makroglobulinu. Tento typ čištění je užitečné při odstraňování přebytečného albumin a alfa 2 -makroglobulin kontaminaci, při provádění hmotnostní spektrometrie. Při afinitní purifikaci sérového albuminu může být stacionárním materiálem používaným ke shromažďování nebo přitahování sérových proteinů Cibacron Blue-Sepharose. Poté mohou být proteiny séra eluovány z adsorbentu pufrem obsahujícím thiokyanát (SCN - ).

Slabá afinitní chromatografie

Slabá afinitní chromatografie (WAC) je afinitní chromatografická technika pro afinitní screening při vývoji léčiv. WAC je metoda kapalinové chromatografie na afinitní bázi, která odděluje chemické sloučeniny na základě jejich různých slabých afinit na imobilizovaný cíl. Čím vyšší afinitu má sloučenina k cíli, tím déle zůstává v separační jednotce, a to bude vyjádřeno jako delší retenční čas. Míry afinity a pořadí afinity lze dosáhnout zpracováním získaných retenčních časů analyzovaných sloučenin.

Technologie WAC je demonstrována proti řadě různých proteinových cílů - proteázy , kinázy , chaperony a cíle interakce protein -protein (PPI). Ukázalo se, že WAC je účinnější než zavedené metody pro screening založený na fragmentech.

Dějiny

Afinitní chromatografie byla vytvořena a poprvé vyvinuta Pedro Cuatrecasasem a Meirem Wilchkem .

Reference

externí odkazy

„Princip, postup a předběžná chromatografie afinity, podrobná poznámka - 2020“.