Intracelulární pH - Intracellular pH

pH gradient přes membránu, s protony cestujícími transportérem vloženým do membrány.

Intracelulární pH ( pHi ) je měřítkem kyselosti nebo zásaditosti (tj. PH ) intracelulární tekutiny . PHi hraje klíčovou roli v membránovém transportu a dalších intracelulárních procesech. V prostředí s nesprávným pHi mohou mít biologické buňky narušenou funkci. Proto je pHi přísně regulováno, aby byla zajištěna správná buněčná funkce, kontrolovaný růst buněk a normální buněčné procesy. Mechanismy, které regulují pHi, jsou obvykle považovány za transportéry plazmatické membrány, u nichž existují dva hlavní typy - ty, které jsou závislé a ty, které jsou nezávislé na koncentraci bikarbonátu ( HCO-
3
). Fyziologicky normální intracelulární pH je nejčastěji mezi 7,0 a 7,4, ačkoli mezi tkáněmi existuje variabilita (např. Kosterní svalstvo savců mívá pHi 6,8–7,1). V různých organelách existuje také kolísání pH , které může trvat od přibližně 4,5 do 8,0. pHi lze měřit několika různými způsoby.

Homeostáza

Intracelulární pH je typicky nižší než extracelulární pH kvůli nižším koncentracím HCO 3 - . Vzestup extracelulární (například sérum ) parciální tlak z oxidu uhličitého ( pCO 2 ) větší než 45  mm Hg , vede ke vzniku kyseliny uhličité , která způsobuje pokles Phi jak se odloučí :

H 2 O + CO 2 ⇌ H 2 CO 3 ⇌ H + + HCO 3 -

Protože biologické buňky obsahují tekutinu, která může působit jako pufr, lze pHi v určitém rozmezí udržovat poměrně dobře. Buňky nastavit jejich PHI způsobem na zvýšení kyselosti nebo zásaditosti, obvykle s pomocí CO 2 a HCO 3 - senzory prezentovat v membráně buňky. Tyto senzory mohou umožnit H+ odpovídajícím způsobem procházet buněčnou membránou, což umožňuje, aby pHi bylo v tomto ohledu ve vzájemném vztahu s extracelulárním pH.

Mezi hlavní intracelulární pufrovací systémy patří systémy zahrnující proteiny nebo fosfáty. Protože mají proteiny kyselé a zásadité oblasti, mohou sloužit jako donory nebo akceptory protonů za účelem udržení relativně stabilního intracelulárního pH. V případě fosfátového pufru mohou podstatná množství slabé kyseliny a slabé báze konjugátu (H 2 PO 4 - a HPO 4 2– ) přijímat nebo darovat protony odpovídajícím způsobem, aby se zachovalo intracelulární pH:

OH - + H 2 PO 4 - ⇌ H 2 O + HPO 4 2–
H + + HPO 4 2– ⇌ H 2 PO 4 -

V organelách

Přibližné hodnoty pH různých organel v buňce.

PH v konkrétní organele je přizpůsobeno její specifické funkci.

Například lysozomy mají relativně nízké pH 4,5. Techniky fluorescenční mikroskopie navíc ukázaly, že fagocyty mají také relativně nízké vnitřní pH. Jelikož se jedná o degradační organely, které pohlcují a rozkládají jiné látky, vyžadují vysokou vnitřní kyselost, aby mohly úspěšně plnit svou zamýšlenou funkci.

Na rozdíl od relativně nízkého pH uvnitř lysozomů a fagocytů má mitochondriální matrice vnitřní pH kolem 8,0, což je přibližně o 0,9 jednotky pH vyšší než v intermembránovém prostoru. Protože uvnitř mitochondrií musí dojít k oxidační fosforylaci, je tento rozdíl v pH nezbytný k vytvoření gradientu přes membránu. Tento membránový potenciál v konečném důsledku umožňuje mitochondriím generovat velké množství ATP.

Protony čerpané z mitochondriální matrice do mezimembránového prostoru při běhu elektronového transportního řetězce snižují pH mezimembránového prostoru.

Měření

Existuje několik běžných způsobů, kterými lze měřit nitrobuněčné pH (pHi), včetně mikroelektrody, barviva citlivého na pH nebo technikami nukleární magnetické rezonance. Pro měření pH uvnitř organel lze použít techniku ​​využívající zelené fluorescenční proteiny citlivé na pH (GFP).

Celkově mají všechny tři metody své vlastní výhody a nevýhody. Používání barviv je možná nejsnadnější a poměrně přesné, zatímco NMR představuje výzvu být relativně méně přesný. Kromě toho může být použití mikroelektrody obtížné v situacích, kdy jsou buňky příliš malé nebo by neporušenost buněčné membrány měla zůstat neporušená. GFP jsou jedinečné v tom, že poskytují neinvazivní způsob určování pH uvnitř různých organel, přesto tato metoda není kvantitativně nejpřesnějším způsobem určování pH.

Mikroelektroda

Mikroelektrodová metoda měření pHi spočívá v umístění velmi malé elektrody do cytosolu buňky vytvořením velmi malého otvoru v plazmatické membráně buňky. Vzhledem k tomu, že mikroelektroda má uvnitř tekutinu s vysokou koncentrací H+, vzhledem k vnější straně elektrody, vzniká potenciál v důsledku rozdílu v pH mezi vnitřní a vnější stranou elektrody. Z tohoto rozdílu napětí a předem stanoveného pH pro tekutinu uvnitř elektrody lze určit intracelulární pH (pHi) sledované buňky.

Fluorescenční spektroskopie

Dalším způsobem, jak měřit intracelulární pH (pHi), jsou barviva, která jsou citlivá na pH a při různých hodnotách pH různě fluoreskují. Tato technika, která využívá fluorescenční spektroskopii, spočívá v přidání tohoto speciálního barviva do cytosolu buňky. Budením barviva v buňce energií ze světla a měřením vlnové délky světla uvolněného fotonem, když se vrací do svého přirozeného energetického stavu, lze určit typ přítomného barviva a dát to do souvislosti s intracelulárním pH daného buňka.

Jaderná magnetická rezonance

Kromě použití elektrod a barviv citlivých na pH k měření pHi lze ke kvantifikaci pHi použít také spektroskopii nukleární magnetické rezonance (NMR). NMR, obvykle řečeno, odhaluje informace o vnitřku buňky umístěním buňky do prostředí se silným magnetickým polem. Na základě poměru mezi koncentracemi protonovaných, ve srovnání s deprotonovanými, formami fosfátových sloučenin v dané buňce lze určit vnitřní pH buňky. Kromě toho lze NMR použít také k odhalení přítomnosti intracelulárního sodíku, který může také poskytnout informace o pHi.

Pomocí NMR spektroskopie bylo stanoveno, že lymfocyty udržují konstantní vnitřní pH 7,17 ± 0,06, ačkoli, jako všechny buňky, se intracelulární pH mění stejným směrem jako extracelulární pH.

GFP citlivé na pH

Ke stanovení pH uvnitř organel se jako součást neinvazivní a účinné techniky často používají GFP citlivé na pH. Použitím cDNA jako templátu spolu s příslušnými primery může být gen GFP exprimován v cytosolu a produkované proteiny mohou cílit na specifické oblasti v buňce, jako jsou mitochondrie, golgiho aparát, cytoplazma a endoplazmatické retikulum. Pokud jsou v těchto experimentech použity určité GFP mutanty, které jsou vysoce citlivé na pH v intracelulárním prostředí, relativní množství výsledné fluorescence může odhalit přibližné okolní pH.

Reference