Iontová chromatografie - Ion chromatography

Moderní iontový chromatografický systém

Iontová chromatografie (nebo iontoměničová chromatografie ) odděluje ionty a polární molekuly na základě jejich afinity k iontoměniči . Funguje na téměř jakýkoli druh nabité molekuly - včetně velkých proteinů , malých nukleotidů a aminokyselin . Iontová chromatografie však musí být prováděna za podmínek, které jsou vzdáleny jednu jednotku od izoelektrického bodu proteinu.

Dva typy iontové chromatografie jsou výměna aniontů a výměna kationtů. Kationtoměničová chromatografie se používá, když je požadovaná molekula kladně nabitá. Molekula je kladně nabitá, protože pH pro chromatografii je nižší než pI (a / k / a pH (I)). V tomto typu chromatografie je stacionární fáze záporně nabitá a kladně nabité molekuly jsou nabity, aby ji přitahovaly. Aniontoměničová chromatografie je, když je stacionární fáze kladně nabitá a záporně nabité molekuly (což znamená, že pH pro chromatografii je vyšší než pí) jsou k ní přitahovány. Často se používá při čištění bílkovin, analýze vody a kontrole kvality. Ve vodě rozpustné a nabité molekuly, jako jsou proteiny, aminokyseliny a peptidy, se vážou na zbytky, které jsou opačně nabité vytvářením iontových vazeb na nerozpustnou stacionární fázi. Vyvážená stacionární fáze se skládá z ionizovatelné funkční skupiny, kde se cílové molekuly směsi, které se mají separovat a kvantifikovat, mohou vázat při průchodu kolonou - kationtová stacionární fáze se používá k oddělení aniontů a aniontová stacionární fáze se používá k oddělení kationů. Kationtoměničová chromatografie se používá, když požadovanými molekulami k oddělení jsou kationty a anexová chromatografie se používá k oddělení aniontů. Navázané molekuly pak mohou být eluovány a shromážděny pomocí eluentu, který obsahuje anionty a kationty, spuštěním vyšší koncentrace iontů přes kolonu nebo změnou pH kolony.

Jednou z hlavních výhod pro použití iontové chromatografie je pouze jedna interakce zapojená během separace na rozdíl od jiných separačních technik; iontová chromatografie proto může mít vyšší toleranci matrice. Další výhodou iontové výměny je předvídatelnost elučních vzorců (na základě přítomnosti ionizovatelné skupiny). Například když se použije kationtoměničová chromatografie, kationty se vymývají jako poslední. Mezitím budou záporně nabité molekuly eluovány jako první. Při provádění iontoměničové chromatografie však existují i ​​nevýhody, jako je neustálý vývoj technikou, která vede k nekonzistenci mezi sloupci. Hlavním omezením této techniky čištění je to, že je omezena na ionizovatelnou skupinu.

Dějiny

Iontoměničová chromatografie

Iontová chromatografie postupovala hromaděním znalostí v průběhu mnoha let. Počínaje rokem 1947 použili Spedding a Powell pro separaci vzácných zemin vytěsňovací iontoměničovou chromatografii. Dále prokázaly iontově výměnnou separaci 14N a 15N izotopů v amoniaku. Na začátku 50. let Kraus a Nelson demonstrovali použití mnoha analytických metod pro ionty kovů závislých na jejich separaci jejich chloridových, fluoridových, dusičnanových nebo síranových komplexů aniontovou chromatografií. V letech 1960 až 1980 byla postupně zavedena automatická in-line detekce i nové chromatografické metody pro separaci kovových iontů. Průkopnická metoda, kterou provedli Small, Stevens a Bauman ve společnosti Dow Chemical Co., rozvinula vytvoření moderní iontové chromatografie. Aniony a kationty lze nyní efektivně oddělit systémem potlačení detekce vodivosti. V roce 1979 zavedli metodu pro aniontovou chromatografii s detekcí nepotlačené vodivosti Gjerde et al. Po ní v roce 1980 byla podobná metoda pro kationtovou chromatografii.

Výsledkem bylo, že na trhu s IC začalo období extrémní konkurence, kdy příznivci potlačovali i nepotlačovali detekci vodivosti. Tato soutěž vedla k rychlému růstu nových forem a rychlému vývoji IC. Výzvou, kterou je třeba v budoucím vývoji IC překonat, je příprava vysoce účinných monolitických iontoměničových kolon a překonání této výzvy by mělo pro vývoj IC velký význam.

Rozmach iontoměničové chromatografie začal primárně mezi lety 1935–1950 během druhé světové války a díky „ projektu na Manhattanu “ došlo k výraznému rozšíření aplikací a IC. Iontovou chromatografii původně představili dva angličtí vědci, zemědělský sir Thompson a chemik JT Way. Práce Thompsona a Waye zahrnovaly působení ve vodě rozpustných solí hnojiv, síranu amonného a chloridu draselného. Tyto soli nemohly být snadno deštěny ze země kvůli dešti. Provedli iontové metody k ošetření jílů solemi, což mělo za následek kromě uvolnění vápníku také extrakci amoniaku. Bylo to v padesátých a šedesátých letech, kdy byly pro IC vyvinuty teoretické modely pro další porozumění a teprve v sedmdesátých letech byly použity kontinuální detektory, které připravily cestu pro vývoj od nízkotlaké po vysoce výkonnou chromatografii. Teprve v roce 1975 byla zavedena „iontová chromatografie“ jako název s odkazem na techniky a poté byla použita jako název pro marketingové účely. IC je dnes důležitý pro zkoumání vodných systémů, jako je pitná voda. Jedná se o oblíbenou metodu pro analýzu aniontových prvků nebo komplexů, které pomáhají řešit problémy související s životním prostředím. Podobně má také velké využití v polovodičovém průmyslu.

Protože jsou k dispozici bohaté separační kolony, eluční systémy a detektory, vyvinula se chromatografie v hlavní metodu pro iontovou analýzu.

Když byla tato technika původně vyvinuta, byla primárně používána pro úpravu vody. Od roku 1935 se iontoměničová chromatografie rychle projevila v jedné z nejvíce využívaných technik a její principy se často aplikují na většinu oblastí chemie, včetně destilace, adsorpce a filtrace.

Zásada

Iontový chromatogram zobrazující separaci aniontů

Iontoměničová chromatografie odděluje molekuly na základě jejich příslušných nabitých skupin. Iontoměničová chromatografie zadržuje molekuly analytu na koloně na základě coulombických (iontových) interakcí. Matice iontoměničové chromatografie se skládá z kladně a záporně nabitých iontů. Molekuly v zásadě procházejí elektrostatickými interakcemi s opačnými náboji na matici stacionární fáze. Stacionární fáze se skládá z nepohyblivé matrice, která obsahuje nabité ionizovatelné funkční skupiny nebo ligandy. Povrch stacionární fáze zobrazuje iontové funkční skupiny (RX), které interagují s ionty analytů s opačným nábojem. K dosažení elektroneutality se tyto inertní náboje spojují s vyměnitelnými protiionty v roztoku. Ionizovatelné molekuly, které mají být čištěny, soutěží s těmito vyměnitelnými protiionty o vazbu na imobilizované náboje ve stacionární fázi. Tyto ionizovatelné molekuly jsou zadržovány nebo eluovány na základě jejich náboje. Zpočátku se nejprve odplaví molekuly, které se neváží nebo se neváží slabě na stacionární fázi. K eluci molekul, které se vážou na stacionární fázi, jsou zapotřebí změněné podmínky. Koncentrace vyměnitelných protiiontů, které soutěží s molekulami o vazbu, může být zvýšena nebo může být změněno pH. Změna pH ovlivňuje náboj konkrétních molekul, a proto mění vazbu. Molekuly se poté začnou vymývat na základě změn jejich nábojů z úprav. Další takové úpravy lze použít k uvolnění požadovaného proteinu. Kromě toho lze koncentraci protiiontů postupně měnit, aby se oddělily ionizované molekuly. Tento typ eluce se nazývá gradientová eluce. Na druhou stranu lze použít krokovou eluci, při které se koncentrace protiiontů mění v jednom kroku. Tento typ chromatografie se dále dělí na katexovou chromatografii a anexovou chromatografii . Pozitivně nabité molekuly se vážou na kationtoměničové pryskyřice, zatímco záporně nabité molekuly se vážou na anexové pryskyřice. Iontová sloučenina sestávající z kationtového druhu M + a aniontového druhu B- může být zadržena stacionární fází.

Kationtoměničová chromatografie si zachovává kladně nabité kationty, protože stacionární fáze zobrazuje záporně nabitou funkční skupinu:

${\ displaystyle {\ text {RX}} ^ {-} {\ text {C}} ^ {+} \, + \, {\ text {M}} ^ {+} \, {\ text {B}} ^ {-} \ rightleftarrows \, ​​{\ text {RX}} ^ {-} {\ text {M}} ^ {+} \, + \, {\ text {C}} ^ {+} \, + \ , {\ text {B}} ^ {-}}$

Aniontoměničová chromatografie zadržuje anionty pomocí kladně nabité funkční skupiny:

${\ displaystyle {\ text {RX}} ^ {+} {\ text {A}} ^ {-} \, + \, {\ text {M}} ^ {+} \, {\ text {B}} ^ {-} \ rightleftarrows \, ​​{\ text {RX}} ^ {+} {\ text {B}} ^ {-} \, + \, {\ text {M}} ^ {+} \, + \ , {\ text {A}} ^ {-}}$

Všimněte si, že iontovou sílu buď C + nebo A- v mobilní fázi lze upravit tak, aby posunula rovnovážnou polohu, tedy retenční čas.

Iontový chromatogram ukazuje typický chromatogram získaný na anexové koloně.

Postup

Před zahájením iontoměničové chromatografie je nutné provést ekvilibraci. Stacionární fáze musí být v rovnováze s určitými požadavky, které závisí na experimentu, se kterým pracujete. Jakmile jsou ekvilibrovány, nabité ionty ve stacionární fázi budou připojeny k opačným nabitým vyměnitelným iontům. Vyměnitelné ionty, jako je Cl- nebo Na +. Dále by měl být vybrán pufr, na který se může vázat požadovaný protein. Po ekvilibraci je třeba kolonu promýt. Promývací fáze pomůže vyloučit všechny nečistoty, které se neváží na matrici, zatímco požadovaný protein zůstává vázán. Tento vzorkový pufr musí mít stejné pH jako pufr používaný pro ekvilibraci, aby pomohl vázat požadované proteiny. Nenabité proteiny budou z kolony eluovány podobnou rychlostí jako pufr protékající kolonou. Jakmile byl vzorek nanesen na kolonu a kolona byla promyta pufrem k vymývání všech nežádoucích proteinů, je provedena eluce k vymývání požadovaných proteinů, které jsou navázány na matrici. Navázané proteiny se vymývají pomocí gradientu lineárně se zvyšující koncentrace soli. Se zvyšující se iontovou silou pufru budou solné ionty soutěžit s požadovanými proteiny, aby se mohly vázat na nabité skupiny na povrchu média. To způsobí vymývání požadovaných proteinů z kolony. Proteiny, které mají nízký čistý náboj, budou eluovány jako první, jakmile se zvýší koncentrace soli, což způsobí zvýšení iontové síly. Proteiny s vysokým čistým nábojem budou potřebovat vyšší iontovou sílu, aby mohly být vymyty z kolony. Je možné provádět iontoměničovou chromatografii hromadně, na tenkých vrstvách média, jako jsou skleněné nebo plastové desky potažené vrstvou požadované stacionární fáze, nebo v chromatografických kolonách. Tenkovrstvá chromatografie nebo sloupcová chromatografie sdílejí podobnosti v tom, že obě působí ve stejných řídících principech; při pohybu mobilní fáze podél stacionární fáze dochází k neustálé a časté výměně molekul. Není nutné přidávat vzorek v minutových objemech, protože byly zvoleny předem stanovené podmínky pro výměnnou kolonu, aby došlo k silné interakci mezi mobilní a stacionární fází. Mechanismus elučního procesu dále způsobí rozčlenění různých molekul na základě jejich příslušných chemických charakteristik. Tento jev je způsoben zvýšením koncentrací solí v horní části kolony nebo v její blízkosti, čímž dojde k přemístění molekul v této poloze, zatímco molekuly vázané níže se uvolní v pozdějším okamžiku, kdy vyšší koncentrace soli dosáhne této oblasti. Tyto principy jsou důvody, proč je iontoměničová chromatografie vynikajícím kandidátem na počáteční kroky chromatografie v komplexním postupu čištění, protože může rychle poskytnout malé objemy cílových molekul bez ohledu na větší počáteční objem.

Komora (vlevo) obsahuje vysokou koncentraci solí. Míchaná komora (vpravo) obsahuje nízkou koncentraci soli. Postupné míchání způsobuje vznik gradientu soli, když se sůl pohybuje z vysoké na nízkou koncentraci.

Srovnatelně jednoduchá zařízení se často používají k aplikaci protiiontů zvyšujícího se gradientu na chromatografickou kolonu. Nejúčinnější látky, jako je měď (II), se volí nejčastěji pro účinnou separaci peptidů a aminokyselin prostřednictvím tvorby komplexů.

K vytvoření gradientu soli lze použít jednoduché zařízení. Eluční pufr je důsledně nasáván z komory do směšovací komory, čímž se mění jeho koncentrace pufru. Obecně má pufr umístěný do komory obvykle vysokou počáteční koncentraci, zatímco pufr umístěný do míchané komory má obvykle nízkou koncentraci. Když je pufr s vysokou koncentrací z levé komory smíchán a natažen do kolony, koncentrace pufru v míchané koloně se postupně zvyšuje. Změna tvarů míchané komory, stejně jako mezního nárazníku, umožňuje výrobu konkávních, lineárních nebo konvexních gradientů protiiontu.

Pro stacionární fázi se používá velké množství různých médií. Mezi nejběžnější používané imobilizované nabité skupiny patří trimethylaminoethyl (TAM), triethylaminoetyl (TEAE), diethyl-2-hydroxypropylaminoetyl (QAE), aminoethyl (AE), diethylaminoethyl (DEAE), sulfo (S), sulfomethyl (SM), sulphopropyl ( SP), karboxy (C) a karboxymethyl (CM).

Úspěšné zabalení kolony je důležitým aspektem iontové chromatografie. Stabilita a účinnost konečné kolony závisí na způsobech balení, použitém rozpouštědle a faktorech, které ovlivňují mechanické vlastnosti kolony. Na rozdíl od časných neúčinných metod suchého balení vykazuje ucpávání mokré suspenze, při kterém jsou částice, které jsou suspendovány ve vhodném rozpouštědle, dodávány do kolony pod tlakem, významné zlepšení. Při plnění vlhké suspenze lze použít tři různé přístupy: metoda vyvážené hustoty (hustota rozpouštědla je přibližně hustota porézních částic oxidu křemičitého), metoda s vysokou viskozitou (používá se rozpouštědlo s vysokou viskozitou) a metoda s nízkou viskozitou suspenze s nízkoviskózními rozpouštědly).

Polystyren se používá jako médium pro iontovou výměnu. Vyrábí se polymerací styrenu za použití divinylbenzenu a benzoylperoxidu. Takové výměníky vytvářejí hydrofobní interakce s proteiny, které mohou být nevratné. Kvůli této vlastnosti nejsou polystyrenové iontoměniče vhodné pro separaci proteinů. Na druhé straně se používají k oddělování malých molekul při oddělování aminokyselin a odstraňování soli z vody. K oddělování bílkovin lze použít polystyrenové iontoměniče s velkými póry, musí však být potaženy hydrofilní látkou.

Médium na bázi celulózy lze použít k oddělení velkých molekul, protože obsahují velké póry. Vazba na bílkoviny v tomto médiu je vysoká a má nízký hydrofobní charakter. DEAE je anexová matrice, která se vyrábí ze skupiny pozitivních diethylaminoethyl vázaných na celulózu nebo Sephadex.

Médium na bázi agarózového gelu obsahuje také velké póry, ale jejich substituční schopnost je ve srovnání s dextrany nižší. Schopnost média bobtnat v kapalině je založena na zesíťování těchto látek, pH a koncentraci iontů použitých pufrů.

Začlenění vysoké teploty a tlaku umožňuje významné zvýšení účinnosti iontové chromatografie spolu se zkrácením času. Teplota má vliv na selektivitu díky svým účinkům na retenční vlastnosti. Retenční faktor ( k = ( t _R ^g - t _M ^g ) / ( t _M ^g - t _ext )) se zvyšuje s teplotou pro malé ionty a u větších iontů je pozorován opačný trend.

Navzdory iontové selektivitě v různých médiích se provádí další výzkum k provedení iontoměničové chromatografie v rozmezí 40–175 ° C.

Vhodné rozpouštědlo lze zvolit na základě pozorování toho, jak se částice sloupce chovají v rozpouštědle. Pomocí optického mikroskopu lze snadno odlišit požadovaný dispergovaný stav suspenze od agregovaných částic.

Slabé a silné iontoměniče

„Silný“ iontoměnič neztratí náboj na své matrici, jakmile je kolona ekvilibrována, a proto lze použít širokou škálu pH pufrů. „Slabé“ iontoměniče mají rozsah hodnot pH, ve kterých si udrží svůj náboj. Pokud pH pufru použitého pro kolonu se slabou iontovou výměnou jde mimo rozsah kapacity matrice, kolona ztratí distribuci náboje a může dojít ke ztrátě sledované molekuly. Navzdory menšímu rozsahu pH slabých iontoměničů se často používají nad silnými iontoměniči, protože mají větší specificitu. V některých experimentech jsou retenční časy slabých iontoměničů dostatečně dlouhé, aby získaly požadovaná data s vysokou specificitou.

Pryskyřice (často označované jako „perličky“) iontoměničových kolon mohou zahrnovat funkční skupiny, jako jsou slabé / silné kyseliny a slabé / silné báze. Existují také speciální sloupce, které mají pryskyřice s amfoterními funkčními skupinami, které si mohou vyměňovat jak kationty, tak anionty. Některé příklady funkčních skupin výměnné pryskyřice silné iontové jsou kvartérní amoniový kation (Q), který je aniontoměnič, a sulfonové kyseliny (S, -SO ₂ OH), která je katex. Tyto typy výměníků si mohou udržovat hustotu náboje v rozmezí pH 0–14. Příklady funkčních skupin slabé iontoměničové pryskyřice zahrnují diethylaminoethyl (DEAE, -C ₂ H ₄ N (CH ₂ H ₅ ) ₂ ), který je aniontoměnič, a karboxymethyl (CM-CH ₂ -COOH), což je katex. Tyto dva typy výměníků mohou udržovat hustotu náboje svých kolon v rozmezí pH 5–9.

V iontové chromatografii určuje interakce rozpuštěných iontů a stacionární fáze na základě jejich nábojů, které ionty se budou vázat a do jaké míry. Když stacionární fáze obsahuje pozitivní skupiny, které přitahují anionty, nazývá se to anexový výměník; když jsou na stacionární fázi záporné skupiny, přitahují se kationty a jedná se o katex. Přitažlivost mezi ionty a stacionární fází také závisí na pryskyřici, organických částicích použitých jako iontoměniče.

Každá pryskyřice má relativní selektivitu, která se mění podle přítomných rozpuštěných iontů, které budou soutěžit o vazbu k pryskyřičné skupině ve stacionární fázi. Koeficient selektivity, ekvivalent k rovnovážné konstantě, je určen poměrem koncentrací mezi pryskyřicí a každým iontem, avšak obecný trend je ten, že iontoměniče dávají přednost vazbě na iont s vyšším nábojem, menším hydratovaným poloměrem a vyšší polarizovatelnost nebo schopnost rušit elektronový mrak iontu jinými náboji. Navzdory této selektivitě by nadbytečné množství iontu s nižší selektivitou zavedenou do kolony způsobilo, že se menší iont váže více na stacionární fázi, protože koeficient selektivity umožňuje kolísání vazebné reakce, ke které dochází během iontoměničové chromatografie.

Následující tabulka ukazuje běžně používané iontoměniče

Typická technika

Vzorek se zavádí, buď ručně, nebo pomocí automatického vzorkovače , do vzorkovací smyčky známého objemu. Pufrovaný vodný roztok známý jako mobilní fáze nese vzorek z smyčky na sloupec, který obsahuje určitou formu stacionární fáze materiálu. Jedná se obvykle o pryskyřičnou nebo gelovou matrici sestávající z agarózových nebo celulózových kuliček s kovalentně vázanými nabitými funkčními skupinami. K dosažení požadovaného náboje kolony je zapotřebí ekvilibrace stacionární fáze. Pokud není kolona správně ekvilibrována, nemusí se požadovaná molekula silně vázat na kolonu. Cílové analyty (anionty nebo kationty) jsou zadržovány na stacionární fázi, ale lze je eluovat zvýšením koncentrace podobně nabitého druhu, který vytěsňuje ionty analytu ze stacionární fáze. Například v kationtoměničové chromatografii lze pozitivně nabitý analyt vytěsnit přidáním kladně nabitých iontů sodíku. Analytické vzorky, které nás zajímají, musí být poté detekovány určitými prostředky, obvykle vodivostí nebo absorbcí UV / viditelného světla.

Řízení systému IC obvykle vyžaduje chromatografický datový systém (CDS). Kromě systémů IC mohou některé z těchto CDS také řídit plynovou chromatografii (GC) a HPLC.

Membránová výměnná chromatografie

Typ iontoměničové chromatografie, membránová výměna, je relativně nová metoda čištění navržená k překonání omezení používání kolon naplněných kuličkami. Membránová chromatografická zařízení jsou levně masově vyráběná a na jedno použití na rozdíl od jiných chromatografických zařízení, která vyžadují údržbu a čas na prodloužení platnosti. Existují tři typy membránových absorbérů, které se obvykle používají při oddělování látek. Tyto tři typy jsou plochý plech, duté vlákno a radiální tok. Nejběžnějším absorbérem a nejvhodnějším pro membránovou chromatografii je více plochých listů, protože má větší objem absorbentu. Může být použit k překonání omezení přenosu hmoty a poklesu tlaku, což je zvláště výhodné pro izolaci a čištění virů, plazmidové DNA a dalších velkých makromolekul. Kolona je naplněna mikroporézními membránami s vnitřními póry, které obsahují adsorpční skupiny, které mohou vázat cílový protein. Adsorpční membrány jsou k dispozici v různých geometriích a chemii, což umožňuje jejich použití k čištění a také k frakcionaci, koncentraci a čiření v účinnosti, která je desetinásobná oproti použití kuliček. Membrány mohou být připraveny izolací samotné membrány, kde jsou membrány rozřezány na čtverce a imobilizovány. Novější metoda zahrnovala použití živých buněk, které jsou připojeny k nosné membráně a jsou používány pro identifikaci a objasnění signálních molekul.

Oddělování proteinů

Iontoměničová kolona v preparativním měřítku používaná k čištění proteinů .

Iontoměničovou chromatografii lze použít k oddělení proteinů, protože obsahují nabité funkční skupiny. Sledované ionty (v tomto případě nabité proteiny) se vymění za jiné ionty (obvykle H ⁺ ) na nabitém pevném nosiči. Rozpuštěné látky jsou nejčastěji v kapalné fázi, kterou bývá voda. Vezměte například proteiny ve vodě, což by byla kapalná fáze, která prochází kolonou. Kolona je obecně známá jako pevná fáze, protože je naplněna pórovitými syntetickými částicemi, které mají zvláštní náboj. Tyto porézní částice jsou také označovány jako kuličky, mohou být aminovány (obsahující aminoskupiny) nebo mohou mít ionty kovů, aby měly náboj. Kolona může být připravena za použití porézních polymerů, pro makromolekuly nad 100 000 je optimální velikost porézní částice asi 1 μm ² . Je to proto, že pomalá difúze rozpuštěných látek v pórech neomezuje kvalitu separace. Korálky obsahující kladně nabité skupiny, které přitahují záporně nabité proteiny, se běžně označují jako aniontoměničové pryskyřice. Aminokyseliny, které mají záporně nabité boční řetězce při pH 7 (pH vody), jsou glutamát a aspartát. Korálky, které jsou negativně nabité, se nazývají kationtoměničové pryskyřice, protože pozitivně nabité proteiny budou přitahovány. Aminokyseliny, které mají kladně nabité postranní řetězce při pH 7, jsou lysin, histidin a arginin.

Izoelektrický bod je pH, při kterém sloučenina - v tomto případě protein - nemá žádný čistý náboj. Izoelektrický bod nebo PI proteinu lze určit pomocí pKa postranních řetězců, pokud je amino (pozitivní řetězec) schopen zrušit karboxylový (negativní) řetězec, protein by byl na svém PI. Použití pufrů místo vody pro proteiny, které nemají náboj při pH 7, je dobrý nápad, protože umožňuje manipulaci s pH, aby se změnily iontové interakce mezi proteiny a kuličkami. Slabě kyselé nebo bazické postranní řetězce jsou schopné mít náboj, pokud je pH dostatečně vysoké nebo nízké. Oddělení lze dosáhnout na základě přirozeného izoelektrického bodu proteinu. Alternativně může být peptidová značka geneticky přidána k proteinu, aby poskytla proteinu izoelektrický bod od většiny přírodních proteinů (např. 6 argininů pro vazbu na katexovou pryskyřici nebo 6 glutamátů pro vazbu na anexovou pryskyřici, jako je DEAE -Sepharose).

Eluce zvýšením iontové síly mobilní fáze je jemnější. Funguje to proto, že ionty z mobilní fáze interagují s imobilizovanými ionty na stacionární fázi, čímž „stíní“ stacionární fázi před proteinem a nechají protein eluovat.

Eluce z iontoměničových kolon může být citlivá na změny chromatofokusace na jeden náboj . Iontoměničová chromatografie je také užitečná při izolaci specifických multimerních proteinových sestav, což umožňuje čištění specifických komplexů podle počtu i polohy nabitých peptidových značek.

Gibbs – Donnanův efekt

V ionexové chromatografii je účinek Gibbs-Donnan pozorován, když se pH aplikovaného pufru a iontoměniče liší, dokonce až do jedné jednotky pH. Například v aniontoměničových kolonách iontoměniče ruší protony, takže pH pufru v blízkosti kolony se liší, je vyšší než zbytek rozpouštědla. Výsledkem je, že experimentátor musí být opatrný, aby sledované proteiny byly stabilní a správně nabité ve „skutečném“ pH.

Tento účinek nastává v důsledku dvou podobně nabitých částic, jedné z pryskyřice a jedné z roztoku, které se nerozdělí správně mezi oběma stranami; dochází k selektivní absorpci jednoho iontu nad druhým. Například v sulfonované polystyrenové pryskyřici, katexové pryskyřici, by se měl chlorový ion pufru s kyselinou chlorovodíkovou ekvilibrovat do pryskyřice. Jelikož je však koncentrace kyseliny sulfonové v pryskyřici vysoká, nemá vodík HC1 tendenci vstupovat do kolony. To v kombinaci s potřebou elektroneutality vede k tomu, že do pryskyřice vstupuje minimální množství vodíku a chloru.

Použití

Klinická užitečnost

Použití iontové chromatografie lze vidět v argentační chromatografii . Stříbro a sloučeniny obsahující acetylenové a ethylenické vazby mají obvykle velmi slabé interakce. Tento jev byl široce testován na olefinových sloučeninách. Iontové komplexy, které olefiny vytvářejí s ionty stříbra, jsou slabé a vytvářejí se na základě překrývání orbitálů pi, sigma a d a dostupné elektrony proto nezpůsobují žádné skutečné změny v dvojné vazbě. Toto chování bylo manipulováno za účelem oddělení lipidů, zejména mastných kyselin ze směsí do frakcí s různým počtem dvojných vazeb pomocí iontů stříbra. Iontové pryskyřice byly impregnovány ionty stříbra, které byly poté vystaveny působení různých kyselin (kyselina křemičitá) za účelem vymývání mastných kyselin různých charakteristik.

Pro ionty alkalických kovů lze dosáhnout detekčních limitů až 1 μM. Může být použit pro měření HbA1c , porfyrinu a při čištění vody . Iontoměničové pryskyřice (IER) byly široce používány zejména v léčivech kvůli své vysoké kapacitě a nekomplikovanému systému separačního procesu. Jedním ze syntetických použití je použití iontoměničových pryskyřic pro dialýzu ledvin. Tato metoda se používá k oddělení krevních elementů pomocí umělé ledviny s membránou z celulózy.

Další klinickou aplikací iontové chromatografie je technika rychlé aniontoměničové chromatografie používaná k oddělení izoenzymů kreatinkinázy (CK) z lidského séra a tkáně pocházející z pitevního materiálu (většinou se používaly tkáně bohaté na CK, jako je srdeční sval a mozek). Tyto izoenzymy zahrnují MM, MB a BB, které všechny plní stejnou funkci s ohledem na různé aminokyselinové sekvence. Funkce těchto izoenzymů spočívají v přeměně kreatinu pomocí ATP na fosfokreatin vylučující ADP. Mini kolony byly naplněny DEAE-Sephadex A-50 a dále eluovány tris-pufrem chloridem sodným v různých koncentracích (každá koncentrace byla zvolena výhodně pro manipulaci s elucí). Extrakt lidské tkáně byl vložen do sloupců pro oddělení. Všechny frakce byly analyzovány, aby se zjistila celková aktivita CK, a bylo zjištěno, že každý zdroj izoenzymů CK obsahuje charakteristické izoenzymy uvnitř. Nejprve byl eluován CK-MM, pak CK-MB, následovaný CK-BB. Proto lze izoenzymy nalezené v každém vzorku použít k identifikaci zdroje, protože byly tkáňově specifické.

S využitím informací z výsledků lze provést korelaci ohledně diagnózy pacientů a druhu izoenzymů CK nalezených v nejhojnější aktivitě. Z nálezu obsahovalo přibližně 35 ze 71 studovaných pacientů srdeční infarkt (infarkt myokardu) také velké množství izoenzymů CK-MM a CK-MB. Zjištění dále ukazují, že u mnoha dalších diagnóz, včetně selhání ledvin, cerebrovaskulárních onemocnění a plicních onemocnění, bylo zjištěno, že mají pouze izoenzym CK-MM a žádný jiný izoenzym. Výsledky této studie naznačují korelace mezi různými chorobami a nalezenými izoenzymy CK, což potvrzuje předchozí výsledky testů za použití různých technik. Studie o CK-MB nalezené u obětí srdečního infarktu se od této studie a aplikace iontové chromatografie rozšířily.

Průmyslové aplikace

Od roku 1975 je iontová chromatografie široce používána v mnoha průmyslových odvětvích. Hlavními výhodami jsou spolehlivost, velmi dobrá přesnost a přesnost, vysoká selektivita, vysoká rychlost, vysoká účinnost separace a nízké náklady na spotřební materiál. Nejvýznamnějším vývojem v oblasti iontové chromatografie jsou nové metody přípravy vzorků; zlepšení rychlosti a selektivity separace analytů; snížení mezí detekce a mezí kvantifikace; rozšíření rozsahu aplikací; vývoj nových standardních metod; miniaturizace a rozšíření rozsahu analýzy nové skupiny látek. Umožňuje kvantitativní testování elektrolytu a patentovaných přísad do galvanických lázní. Jedná se o pokrok v kvalitativním testování trupových buněk nebo méně přesném UV testování. Lze měřit ionty, katalyzátory, zjasňovače a urychlovače. Iontoměničová chromatografie se postupně stala široce známou univerzální technikou pro detekci aniontových i kationtových druhů. Aplikace pro tyto účely byly vyvinuty nebo jsou vyvíjeny pro různé oblasti zájmu, zejména pro farmaceutický průmysl. Využití iontoměničové chromatografie ve farmaceutických výrobcích v posledních letech vzrostlo a v roce 2006 byla oficiálně přidána kapitola týkající se iontoměničové chromatografie do Národního lékopisu USA (USP-NF). Navíc v roce 2009, kdy byl vydán USP-NF, společnost United States Pharmacopia zpřístupnila několik analýz iontové chromatografie pomocí dvou technik: detekce vodivosti a pulzní amperometrické detekce. Většina těchto aplikací se primárně používá pro měření a analýzu zbytkových limitů ve farmaceutických výrobcích, včetně detekce limitů oxalátu, jodidu, síranu, sulfamátu, fosfátu a různých elektrolytů včetně draslíku a sodíku. Celkově vydání USP-NF z roku 2009 oficiálně uvolnilo dvacet osm metod detekce pro analýzu aktivních sloučenin nebo složek aktivních sloučenin pomocí detekce vodivosti nebo pulzní amperometrické detekce.

Vývoj léků

Systém iontové chromatografie používaný k detekci a měření kationtů, jako je sodík, amonium a draslík, ve formulacích proti vykašlávání proti kašli.

Roste zájem o aplikaci IC při analýze farmaceutických léčiv. IC se používá v různých aspektech vývoje produktu a testování kontroly kvality. Například IC se používá ke zlepšení stabilit a vlastností rozpustnosti molekul farmaceutických aktivních léčiv a také se používá k detekci systémů, které mají vyšší toleranci k organickým rozpouštědlům. IC byl použit pro stanovení analytů jako součást testu rozpouštění. Například testy rozpouštění vápníku ukázaly, že jiné ionty přítomné v médiu mohou být dobře rozděleny mezi sebou a také z iontu vápníku. Proto se IC používá v léčivech ve formě tablet a tobolek, aby se určilo množství léku rozpustného v čase. IC je také široce používán pro detekci a kvantifikaci pomocných látek nebo neaktivních složek používaných ve farmaceutických formulacích. Detekce cukru a cukerného alkoholu v takových formulacích pomocí IC byla provedena kvůli tomu, že tyto polární skupiny byly rozděleny v iontové koloně. Metodika IC byla zavedena také při analýze nečistot v léčivých látkách a výrobcích. Vyhodnocují se nečistoty nebo jakékoli složky, které nejsou součástí chemické entity léčiva, a poskytují informace o maximálním a minimálním množství léčiva, které by mělo být pacientovi denně podáváno.

Viz také

• Aniontoměničová chromatografie
• Chromatofokusace
• Vysoce účinná kapalinová chromatografie
• Isoelektrický bod

Reference

Bibliografie

• Malý, Hamish (1989). Iontová chromatografie . New York: Plenum Press. ISBN 978-0-306-43290-3.
• Tatjana Weiss; Weiss, Joachim (2005). Příručka iontové chromatografie . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-28701-7.
• Gjerde, Douglas T .; Fritz, James S. (2000). Iontová chromatografie . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-29914-0.
• Jackson, Peter; Haddad, Paul R. (1990). Iontová chromatografie: principy a aplikace . Amsterdam: Elsevier. ISBN 978-0-444-88232-5.
• Mercer, Donald W (1974). „Separace tkáňových a sérových izoenzymů kreatinkinázy pomocí iontoměničové sloupcové chromatografie“ . Klinická chemie . 20 (1): 36–40. doi : 10,1093 / clinchem / 20.1.36 . PMID  4809470 .
• Morris, LJ (1966). "Separace lipidů chromatografií na stříbrných iontech" . Journal of Lipid Research . 7 (6): 717–732. doi : 10,1016 / S0022-2275 (20) 38948-3 . PMID  5339485 .
• Ghosh, Raja (2002). "Separace proteinů pomocí membránové chromatografie: příležitosti a výzvy". Journal of Chromatography A . 952 (1): 13–27. doi : 10,1016 / s0021-9673 (02) 00057-2 . PMID  12064524 .

externí odkazy

• Média týkající se iontové chromatografie na Wikimedia Commons

• LC Instruments ve společnosti Curlie