Lysozym - Lysozyme

Glykosidová hydroláza, rodina 22, lysozym
Lysozymecrystals1.png
Krystaly lysozymu obarvené methylenovou modří .
Identifikátory
Symbol ?
InterPro IPR000974
Lysozym
Identifikátory
Č. ES 3.2.1.17
Č. CAS 9001-63-2
Databáze
IntEnz Pohled IntEnz
BRENDA BRENDA vstup
EXPAS Pohled NiceZyme
KEGG KEGG vstup
MetaCyc metabolická cesta
PRIAM profil
PDB struktury Součet RCSB PDB PDBe PDB
Genová ontologie Amigo / QuickGO

Lysozym , také známý jako muramidáza nebo N-acetylmuramid glykanhydroláza , je antimikrobiální enzym produkovaný zvířaty, který tvoří součást vrozeného imunitního systému . Lysozym je glykosidová hydroláza, která katalyzuje hydrolýzu 1,4-beta-vazeb mezi kyselinou N-acetylmuramovou a N-acetyl-D-glukosaminem v peptidoglykanu , který je hlavní složkou grampozitivní buněčné stěny bakterií . Tato hydrolýza zase narušuje integritu bakteriálních buněčných stěn, což způsobuje lýzu bakterií.

Lysozym je bohatý na sekreci včetně slz , slin , lidského mléka a hlenu . Je také přítomen v cytoplazmatických granulích makrofágů a polymorfonukleárních neutrofilů (PMN). Velké množství lysozymu lze nalézt ve vaječném bílku . Lyzozymy typu C jsou v sekvenci a struktuře úzce spjaty s alfa-laktalbuminem , což z nich činí součást stejné rodiny glykosidhydrolázy 22 . U lidí je enzym lysozymu typu C kódován genem LYZ .

Slepičí vaječný bílek lysozym je tepelně stabilní, s bodem tání dosahuje až 72 ° C při pH 5,0. Při této teplotě však lysozym v lidském mléce velmi rychle ztrácí aktivitu. Slepičí vaječný bílek lysozym udržuje svoji aktivitu ve velkém rozmezí pH (6–9). Jeho izoelektrický bod je 11,35. Izoelektrický bod lysozymu lidského mléka je 10,5-11.

Funkce a mechanismus

Tyto enzymové funkce hydrolýzou glykosidickými vazbami v peptidoglykanů . Enzym může také rozbít glykosidické vazby v chitinu , i když ne tak efektivně jako skutečné chitinázy .

Přehled reakce katalyzované lysozymem

Aktivní místo lysozymu váže molekulu peptidoglykanu v prominentní štěrbině mezi jejími dvěma doménami. Útočí na peptidoglykany (nacházejí se v buněčných stěnách bakterií, zejména grampozitivních bakterií ), což je jeho přirozený substrát, mezi kyselinou N- acetylmuramovou (NAM) a čtvrtým atomem uhlíku N-acetylglukosaminu (NAG).

Kratší sacharidy, jako je tetrasacharid, se také ukázaly jako životaschopné substráty, ale prostřednictvím meziproduktu s delším řetězcem. Ukázalo se také, že chitin je životaschopný substrát lysozymu. Umělé substráty byly také vyvinuty a použity v lysozymu.

Mechanismus

Phillipse

Phillipsův mechanismus navrhl, aby katalytická síla enzymu pocházela jak ze sterického kmene na vázaném substrátu, tak z elektrostatické stabilizace oxokarbeniového meziproduktu. Z rentgenových krystalografických dat navrhl Phillips aktivní místo enzymu, kde se váže hexasacharid. Lyzozym zkresluje čtvrtý cukr (v podskupině D nebo -1) v hexasacharidu do konformace v polokřesle. V tomto stresovaném stavu je glykosidická vazba snadněji přerušena. V důsledku přerušení glykosidické vazby vzniká iontový meziprodukt obsahující oxokarbenium . Zkreslení, které způsobí, že molekula substrátu přijme napjatou konformaci podobnou transformačnímu stavu, sníží energetickou bariéru reakce.

Arieh Warshel v roce 1978 předpokládal, že navrhovaný oxo-karboniový meziprodukt bude elektrostaticky stabilizován zbytky aspartátu a glutamátu v aktivním místě . Argument elektrostatické stabilizace byl založen na srovnání s objemovou vodou, přeorientace vodních dipólů může zrušit stabilizační energii interakce náboje. Ve Warshelově modelu působí enzym jako super-rozpouštědlo, které fixuje orientaci iontových párů a poskytuje supersolvataci (velmi dobrá stabilizace iontových párů), a zejména snižuje energii, když jsou dva ionty blízko sebe.

Krok určující rychlost (RDS) v tomto mechanizmu se vztahuje k tvorbě oxo-karbeniový meziproduktu. Existovaly určité protichůdné výsledky, které naznačovaly přesné RDS. Sledováním tvorby produktu ( p-nitrofenol ) bylo zjištěno, že se RDS může měnit při různých teplotách, což byl důvod těchto protichůdných výsledků. Při vyšší teplotě RDS tvoří meziprodukt glykosylového enzymu a při nižší teplotě rozpad tohoto meziproduktu.

Kovalentní meziprodukt enzymu lysozym, s kovalentní vazbou v černé barvě a experimentální důkaz jako modrá síť.

Koshland

Substráty v experimentu Vocadla

V rané debatě v roce 1969 navrhl Dahlquist kovalentní mechanismus pro lysozym na základě kinetického izotopového efektu , ale po dlouhou dobu byl iontový mechanismus více přijímán. V roce 2001 navrhl Vocadlo revidovaný mechanismus prostřednictvím kovalentního, ale ne iontového meziproduktu. Důkazy z ESI - MS analýzy naznačovaly kovalentní meziprodukt. Ke snížení reakční rychlosti a akumulaci meziproduktu pro charakterizaci byl použit substrát substituovaný 2-fluorem. Bylo zjištěno, že postranní řetězce aminokyselin kyselina glutamová 35 (Glu35) a aspartát 52 (Asp52) jsou kritické pro aktivitu tohoto enzymu. Glu35 působí jako donor protonů ke glykosidické vazbě, štěpí vazbu CO v substrátu, zatímco Asp52 působí jako nukleofil ke generování meziproduktu glykosylového enzymu. Glu35 reaguje s vodou za vzniku hydroxylového iontu, silnějšího nukleofilu než voda, který pak útočí na meziprodukt glykosylového enzymu, za vzniku produktu hydrolýzy a ponechání enzymu beze změny. Tento kovalentní mechanismus byl pojmenován po Koshlandovi , který jako první navrhl tento typ mechanismu.

Nověji simulace molekulární dynamiky kvantové mechaniky/ molekulární mechaniky (QM/ MM) používají krystal HEWL a předpovídají existenci kovalentního meziproduktu. Důkazy pro ESI-MS a rentgenové struktury naznačují existenci kovalentního meziproduktu, ale primárně se spoléhají na použití méně aktivního mutantního nebo nepůvodního substrátu. Molekulární dynamika QM/MM tedy poskytuje jedinečnou schopnost přímo zkoumat mechanismus divokého typu HEWL a nativního substrátu. Výpočty odhalily, že kovalentní meziprodukt z Koshlandova mechanismu je o ~ 30 kcal/mol stabilnější než iontový meziprodukt z Phillipsova mechanismu. Tyto výpočty ukazují, že iontový meziprodukt je extrémně energeticky nepříznivý a kovalentní meziprodukty pozorované z experimentů s použitím méně aktivních mutantních nebo nepůvodních substrátů poskytují užitečný pohled na mechanismus divokého typu HEWL.

Dva možné mechanismy lysozymu

Inhibice

Deriváty imidazolu mohou tvořit komplex přenosu náboje s některými zbytky (v aktivním centru nebo mimo něj), aby se dosáhlo kompetitivní inhibice lysozymu. V gram-negativních bakterií je lipopolysacharid působí jako nekompetitivní inhibitior o velmi oblíbené vazba s lysozymem.

Neenzymatické působení

Navzdory tomu měla muramidázová aktivita lysozymu hrát klíčovou roli pro jeho antibakteriální vlastnosti, byly také hlášeny důkazy o jeho neenzymatickém účinku. Například blokování katalytické aktivity lysozymu mutací kritické aminokyseliny v aktivním místě (52- Asp- > 52- Ser ) nevylučuje jeho antimikrobiální aktivitu. Lektinu jako schopnost lysozymu rozeznat bakteriální sacharidový antigen bez lytické aktivity byl zaznamenán u tetrasacharidu související s lipopolysacharidu z Klebsiella pneumoniae . Lysozym také interaguje s protilátkami a receptory T-buněk .

Změny konformace enzymu

Lysozym vykazuje dvě konformace: otevřený aktivní stav a uzavřený neaktivní stav. Katalytický význam byl zkoumán s tranzistory s efektem pole s jednostěnnými uhlíkovými nanotrubičkami (SWCN) (FET), kde byl na SWCN FET vázán singulární lysozym. Elektronické monitorování lysozymu ukázalo dvě konformace, otevřené aktivní místo a uzavřené neaktivní místo. V aktivním stavu je lysozym schopen procesně hydrolyzovat svůj substrát, přičemž rozbíjí v průměru 100 vazeb rychlostí 15 za sekundu. Aby bylo možné vázat nový substrát a přejít z uzavřeného neaktivního stavu do otevřeného aktivního stavu, vyžadují dvě změny kroku konformace, zatímco deaktivace vyžaduje jeden krok.

Role v nemoci a terapii

LYZ
Dostupné struktury
PDB Hledání ortologů : PDBe RCSB
Identifikátory
Přezdívky LYZ , LZM, LYZF1, lysozym
Externí ID OMIM : 153450 MGI : 96902 HomoloGene : 121490 Genové karty : LYZ
Ortology
Druh Člověk Myš
Entrez
Ensembl
UniProt
RefSeq (mRNA)

NM_000239

NM_013590

RefSeq (protein)

NP_000230

NP_038618

Umístění (UCSC) Chr 12: 69,35 - 69,35 Mb Chr 10: 117,29 - 117,29 Mb
Hledání PubMed
Wikidata
Zobrazit/upravit člověka Zobrazit/upravit myš

Lysozym je součástí vrozeného imunitního systému. Snížené hladiny lysozymu byly u novorozenců spojeny s bronchopulmonální dysplazií . Selata krmená lidským lysozymovým mlékem se mohou rychleji zotavit z průjmového onemocnění způsobeného E. coli . Koncentrace lysozymu v lidském mléce je 1 600 až 3 000krát větší než koncentrace v mléce hospodářských zvířat. Lidský lysozym je aktivnější než lysozym ze slepičích vaječných bílků. Transgenní linie koz (s zakladatelem názvem „Artemis“) byly vyvinuty pro produkci mléka s lidským lysozymem k ochraně dětí před průjmem, pokud nemohou získat výhody lidského kojení.

Jelikož je lysozym přirozenou formou ochrany před grampozitivními patogeny, jako jsou Bacillus a Streptococcus , hraje důležitou roli v imunologii kojenců při krmení mlékem. Zatímco kůže je díky své suchosti a kyselosti ochrannou bariérou, spojivka (membrána pokrývající oko) je místo toho chráněna vylučovanými enzymy, zejména lysozymem a defensinem . Když však tyto ochranné bariéry selžou, dojde ke konjunktivitidě .

U některých typů rakoviny (zejména myelomonocytární leukémie) může nadměrná produkce lysozymu rakovinnými buňkami vést k toxickým hladinám lysozymu v krvi. Vysoké hladiny lysozymu v krvi mohou vést k selhání ledvin a nízké hladině draslíku v krvi, což jsou stavy, které se mohou zlepšit nebo vyřešit léčbou primární malignity.

Sérový lysozym je pro diagnostiku sarkoidózy mnohem méně specifický než sérum angiotensin konvertující enzym; protože je citlivější, používá se jako marker aktivity onemocnění sarkoidózou a je vhodný pro monitorování onemocnění v prokázaných případech.

Chemická syntéza

O první chemickou syntézu lysozymového proteinu se pokusil prof. George W. Kenner a jeho skupina na univerzitě v Liverpoolu v Anglii. Toho nakonec dosáhl v roce 2007 Thomas Durek v laboratoři Steva Kenta na Chicagské univerzitě, který vyrobil syntetickou funkční molekulu lysozymu.

Další aplikace

Krystaly lysozymu byly použity k pěstování dalších funkčních materiálů pro katalýzu a biomedicínské aplikace. Lysozym je běžně používaný enzym pro lýzu grampozitivních bakterií. Díky jedinečné funkci lysozymu, ve které může trávit buněčnou stěnu a způsobuje osmotický šok (roztržení buňky náhlou změnou koncentrace rozpuštěné látky kolem buňky a tím i osmotického tlaku ), se lysozym běžně používá v laboratorních podmínkách k uvolňování proteinů z bakterií periplazma, zatímco vnitřní membrána zůstává utěsněna jako vezikuly nazývané sféroidy .

Například, E. coli, může být lyžovány použitím lysozymu uvolnit obsah periplazmatického prostoru. Je to zvláště užitečné v laboratorních podmínkách při pokusu shromáždit obsah periplazmy. Ošetření lyzozymem je optimální při určitých teplotách, rozmezí pH a koncentracích solí. Aktivita lyzozymu se zvyšuje se zvyšujícími se teplotami, až do 60 stupňů Celsia, s rozsahem pH 6,0-7,0. Přítomné soli také ovlivňují léčbu lysozymem, kde některé vykazují inhibiční účinky a jiné podporují lýzu ošetřením lysozymem. Chlorid sodný vyvolává lýzu, ale ve vysokých koncentracích je aktivním inhibitorem lýzy. Podobná pozorování byla pozorována při použití draselných solí. V důsledku rozdílů v bakteriálních kmenech jsou přítomny mírné odchylky.

Dějiny

Antibakteriální vlastnosti slepičího vaječného bílku díky lysozymu, který obsahuje, poprvé pozoroval Laschtschenko v roce 1909. Aktivitu nosního hlenu zabíjející bakterie prokázal v roce 1922 Alexander Fleming , objevitel penicilinu , který razil termín lysozym. Oznámil to Fleming. „Jelikož má tato látka podobné vlastnosti jako fermenty, nazval jsem ji„ lysozym “. Fleming dále ukázal, že enzymatická látka je přítomna v široké škále sekrecí a je schopná rychle lyžovat (tj. Rozpouštět) různé bakterie, zejména žlutý „kokus“, který studoval.

Lysozym byl poprvé krystalizován Edwardem Abrahamem v roce 1937, což umožnilo popsat trojrozměrnou strukturu lysozymu slepičích vaječných bílků Davidem Chiltonem Phillipsem v roce 1965, kdy prostřednictvím rentgenové krystalografie získal první model rozlišení 2- ångström (200 pm ) . Struktura byla veřejně představena na přednášce Royal Institution v roce 1965. Lysozym byl druhou proteinovou strukturou a první strukturou enzymu, která měla být vyřešena pomocí rentgenových difrakčních metod, a prvním enzymem, který byl plně sekvenován a který obsahoval všech dvacet běžných aminokyselin. V důsledku Phillipsova objasnění struktury lysozymu to byl také první enzym, který měl podrobný a specifický mechanismus navržený pro jeho způsob katalytického působení. Tato práce vedla společnost Phillips k poskytnutí vysvětlení, jak enzymy urychlují chemickou reakci, pokud jde o její fyzikální struktury. Původní mechanismus navržený Phillipsem byl nedávno revidován.

Viz také

Reference

externí odkazy