Hmotnostní spektrometrie - Mass spectrometry

Hmotnostní spektrometrie ( MS ) je analytická technika, která se používá k měření poměr hmoty k náboji z iontů . Výsledky jsou prezentovány jako hmotnostní spektrum , graf intenzity jako funkce poměru hmotnosti a náboje. Hmotnostní spektrometrie se používá v mnoha různých oblastech a je aplikována na čisté vzorky i na komplexní směsi.

Hmotnostní spektrum je graf iontového signálu v závislosti na poměru hmotnosti k náboji. Tato spektra se používají ke stanovení elementárního nebo izotopového podpisu vzorku, hmotnosti částic a molekul a k objasnění chemické identity nebo struktury molekul a dalších chemických sloučenin .

V typickém postupu MS je vzorek, který může být pevný, kapalný nebo plynný, ionizován, například bombardováním paprskem elektronů . To může způsobit, že se některé molekuly vzorku rozpadnou na kladně nabité fragmenty nebo se jednoduše nabijí kladně bez fragmentace. Tyto ionty (fragmenty) se poté oddělí podle poměru hmotnosti k náboji, například jejich zrychlením a vystavením elektrickému nebo magnetickému poli: ionty se stejným poměrem hmotnosti k náboji projdou stejným průhybem . Ionty jsou detekovány mechanismem schopným detekovat nabité částice, jako je elektronový multiplikátor . Výsledky jsou zobrazeny jako spektra intenzity signálu detekovaných iontů v závislosti na poměru hmotnosti a náboje. Atomy nebo molekuly ve vzorku lze identifikovat korelací známých hmot (např. Celé molekuly) s identifikovanými hmotami nebo pomocí charakteristického fragmentačního vzoru.

Historie hmotnostního spektrometru

V roce 1886 Eugen Goldstein pozoroval paprsky v plynových výbojích pod nízkým tlakem, které cestovaly pryč od anody a kanály v perforované katodě , opačně ke směru záporně nabitých katodových paprsků (které putují z katody na anodu). Goldstein nazval tyto kladně nabité anodové paprsky „Kanalstrahlen“; standardní překlad tohoto výrazu do angličtiny je „ canal ray “. Wilhelm Wien zjistil, že silná elektrická nebo magnetická pole vychylují paprsky kanálů, a v roce 1899 zkonstruoval zařízení s kolmými elektrickými a magnetickými poli, která oddělovala kladné paprsky podle poměru jejich náboje k hmotnosti ( Q/m ). Wien zjistila, že poměr náboje k hmotnosti závisí na povaze plynu ve výbojce. Anglický vědec JJ Thomson později vylepšil práci Wien snížením tlaku na vytvoření hmotnostního spektrografu.

Slovo spektrograf se stalo součástí mezinárodní vědecké slovní zásoby od roku 1884. Prvotní spektrometrická zařízení, která měřila poměr hmotnosti a náboje iontů, se nazývala hmotnostní spektrografy, které sestávaly z přístrojů, které zaznamenávaly spektrum hmotnostních hodnot na fotografickou desku . Hmotnostní spektroskop je podobný hmotnostní spektrometr s výjimkou, že se svazek iontů je vedena na fosforové obrazovky. Konfigurace hmotnostního spektroskopu byla použita v raných přístrojích, když bylo požadováno, aby efekty úprav byly rychle pozorovány. Jakmile byl nástroj správně nastaven, byla vložena a vystavena fotografická deska. Pojem hmotnostní spektroskop se nadále používal, i když přímé osvětlení fosforové obrazovky bylo nahrazeno nepřímým měřením osciloskopem . Používání termínu hmotnostní spektroskopie se nyní nedoporučuje kvůli možnosti záměny se světelnou spektroskopií . Hmotnostní spektrometrie je často zkrácena jako hmotnostní specifikace nebo jednoduše jako MS .

Moderní techniky hmotnostní spektrometrie byly navrženy Arthurem Jeffreyem Dempsterem a FW Astonem v roce 1918 a 1919.

Sektorové hmotnostní spektrometry známé jako calutrony byly vyvinuty Ernestem O. Lawrencem a použity k separaci izotopů uranu během projektu Manhattan . Hmotnostní spektrometry Calutron byly použity k obohacení uranu v závodě Oak Ridge, Tennessee Y-12 zřízeném během druhé světové války.

V roce 1989 byla polovina Nobelovy ceny za fyziku udělena Hansovi Dehmeltovi a Wolfgangu Paulovi za vývoj techniky iontové pasti v 50. a 60. letech minulého století.

V roce 2002 byla Nobelova cena za chemii udělena Johnu Bennettovi Fennovi za vývoj elektrosprejové ionizace (ESI) a Koichi Tanaka za vývoj měkké laserové desorpce (SLD) a jejich aplikaci na ionizaci biologických makromolekul, zejména proteinů.

Části hmotnostního spektrometru

Hmotnostní spektrometr se skládá ze tří složek: zdroje iontů, hmotnostního analyzátoru a detektoru. Ionizátor převádí část vzorku do iontů. Existuje široká škála ionizačních technik v závislosti na fázi (pevné, kapalné, plynné) vzorku a účinnosti různých ionizačních mechanismů pro neznámé druhy. Extrakční systém odebírá ionty ze vzorku, které jsou poté zaměřeny přes hmotnostní analyzátor a do detektoru . Rozdíly v hmotnosti fragmentů umožňují hmotnostnímu analyzátoru třídit ionty podle jejich poměru hmotnosti k náboji. Detektor měří hodnotu indikátorové veličiny a poskytuje tak data pro výpočet hojnosti každého přítomného iontu. Některé detektory také poskytují prostorové informace, např. Vícekanálová deska.

Teoretický příklad

Následující příklad popisuje činnost spektrometrického hmotnostního analyzátoru, který je sektorového typu. (Další typy analyzátorů jsou popsány níže.) Zvažte vzorek chloridu sodného (kuchyňské soli). Ve zdroji iontů je vzorek odpařen (přeměněn na plyn ) a ionizován (přeměněn na elektricky nabité částice) na ionty sodíku (Na ⁺ ) a chloridu (Cl ^- ). Atomy a ionty sodíku jsou monoisotopické s hmotností asi 23 u. Atomy a ionty chloridu se dodávají ve dvou izotopech s hmotností přibližně 35 u (při přirozeném množství asi 75 procent) a přibližně 37 u (při přirozeném množství asi 25 procent). Analyzátorová část spektrometru obsahuje elektrická a magnetická pole, která působí na ionty procházející těmito poli. Rychlost nabité částice může být zvýšena nebo snížena při průchodu elektrickým polem a její směr může být změněn magnetickým polem. Velikost vychýlení trajektorie pohybujícího se iontu závisí na jeho poměru hmotnosti a náboje. Lehčí ionty jsou magnetickou silou vychýleny více než těžší ionty (na základě druhého Newtonova pohybového zákona , F = ma ). Proudy tříděných iontů procházejí z analyzátoru do detektoru, který zaznamenává relativní množství každého iontového typu. Tyto informace se používají ke stanovení složení chemického prvku původního vzorku (tj. Zda je ve vzorku přítomen sodík i chlor) a izotopového složení jeho složek (poměr ³⁵ Cl k ³⁷ Cl).

Vytváření iontů

Zdroj iontů je část hmotnostního spektrometru, která ionizuje analyzovaný materiál (analyt). Ionty jsou poté transportovány magnetickými nebo elektrickými poli do hmotnostního analyzátoru.

Techniky ionizace byly klíčové pro určení, jaké typy vzorků lze analyzovat pomocí hmotnostní spektrometrie. Pro plyny a páry se používá elektronová ionizace a chemická ionizace . V chemických ionizačních zdrojích je analyt ionizován reakcemi chemických iontových molekul během kolizí ve zdroji. Dvě techniky často používané u kapalných a pevných biologických vzorků zahrnují elektrosprejovou ionizaci (vynalezl John Fenn ) a laserovou desorpci/ionizaci pomocí matrice (MALDI, původně vyvinutou jako podobnou techniku ​​„Soft Laser Desorption (SLD)“ od K. Tanaky, pro kterou M. Karas a F. Hillenkamp) udělili Nobelovu cenu a jako MALDI.

Tvrdá ionizace a měkká ionizace

V hmotnostní spektrometrii se ionizace týká produkce iontů plynné fáze vhodných pro rozlišení v hmotnostním analyzátoru nebo hmotnostním filtru. K ionizaci dochází ve zdroji iontů . K dispozici je několik zdrojů iontů ; každý má výhody a nevýhody pro konkrétní aplikace. Například elektronová ionizace (EI) poskytuje vysoký stupeň fragmentace a poskytuje vysoce detailní hmotnostní spektra, která při šikovné analýze mohou poskytnout důležité informace pro strukturální objasnění/charakterizaci a usnadnit identifikaci neznámých sloučenin porovnáním s hmotnostními spektrálními knihovnami získanými za stejných provozních podmínek . EI však není vhodný pro navázání na HPLC , tj. LC-MS , protože při atmosférickém tlaku vlákna použitá ke generování elektronů rychle vyhoří. EI je tedy spojen převážně s GC , tj. GC-MS , kde je celý systém pod vysokým vakuem.

Techniky tvrdé ionizace jsou procesy, které v předmětné molekule přenášejí velké množství zbytkové energie a vyvolávají velké stupně fragmentace (tj. Systematické přetržení vazeb působí tak, že se přebytečná energie odstraní a obnoví se stabilita výsledného iontu). Výsledné ionty mívají m/z nižší než molekulová hmotnost (jiné než v případě přenosu protonu a nezahrnující píky izotopů). Nejběžnějším příkladem tvrdé ionizace je elektronová ionizace (EI).

Měkká ionizace se týká procesů, které dodávají malé zbytkové energii molekule předmětu a jako takové vedou k malé fragmentaci. Mezi příklady patří bombardování rychlými atomy (FAB), chemická ionizace (CI), chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI), fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI), ionizace elektrosprejem (ESI), desorpční elektrosprejová ionizace (DESI) a laser podporovaný matricí desorpce/ionizace (MALDI).

Indukčně vázaná plazma

Zdroje indukčně vázané plazmy (ICP) se používají především pro kationtovou analýzu široké škály typů vzorků. V tomto zdroji je plazma, která je celkově elektricky neutrální, ale která má podstatnou část svých atomů ionizována vysokou teplotou, použita k atomizaci zavedených molekul vzorku a k dalšímu odizolování vnějších elektronů od těchto atomů. Plazma je obvykle generována z argonového plynu, protože první ionizační energie atomů argonu je vyšší než první ze všech ostatních prvků kromě He, F a Ne, ale nižší než druhá ionizační energie všech kromě nejvíce elektropozitivních kovů. Zahřívání je dosahováno vysokofrekvenčním proudem procházejícím cívkou obklopující plazmu.

Fotoionizační hmotnostní spektrometrie

Fotoionizaci lze použít v experimentech, jejichž cílem je použít hmotnostní spektrometrii jako prostředek k řešení mechanismů chemické kinetiky a větvení izomerních produktů. V takových případech se k disociaci stabilních plynných molekul v nosném plynu He nebo Ar použije foton s vysokou energií, buď rentgenový nebo uv. V případech, kdy je použit synchrotronový světelný zdroj, lze použít laditelnou energii fotonu k získání křivky účinnosti fotoionizace, kterou lze použít ve spojení s poměrem náboje m/z k molekulárním a iontovým druhům otisku prstu. Nedávno byla vyvinuta fotoionizace atmosférického tlaku (APPI) k ionizaci molekul převážně jako výtoky ze systémů LC-MS.

Okolní ionizace

Některé aplikace pro ionizaci okolí zahrnují environmentální aplikace i klinické aplikace. Při těchto technikách se ionty tvoří ve zdroji iontů mimo hmotnostní spektrometr. Odběr vzorků je snadný, protože vzorky nepotřebují předchozí separaci ani přípravu. Některé příklady technik okolní ionizace jsou DESI , SESI , LAESI , desorpční atmosférická chemická ionizace za atmosférického tlaku (DAPCI) a desorpční fotoionizace za atmosférického tlaku DAPPI .

Jiné ionizační techniky

Mezi další patří doutnavý výboj , desorpce pole (FD), rychlé atomové bombardování (FAB), termosprej , desorpce/ionizace na křemíku (DIOS), přímá analýza v reálném čase (DART), chemická ionizace atmosférického tlaku (APCI), hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů (SIMS), jiskrovou ionizací a tepelnou ionizací (TIMS).

Hromadný výběr

Hmotnostní analyzátory oddělují ionty podle jejich poměru hmotnosti a náboje . Následující dva zákony řídí dynamiku nabitých částic v elektrických a magnetických polích ve vakuu:

${\ Displaystyle \ mathbf {F} = Q (\ mathbf {E} +\ mathbf {v} \ times \ mathbf {B})}$( Lorentzův zákon síly );

${\ Displaystyle \ mathbf {F} = m \ mathbf {a}}$( Newtonův druhý pohybový zákon v nerelativistickém případě, tj. Platný pouze při iontové rychlosti mnohem nižší, než je rychlost světla).

Zde F je síla působící na iont, m je hmotnost iontu, a je zrychlení, Q je iontový náboj, E je elektrické pole a v × B je vektorový křížový součin rychlosti iontu a magnetické pole

Rovnice výše uvedených výrazů pro sílu působící na výtěžky iontů:

${\ Displaystyle (m/Q) \ mathbf {a} = \ mathbf {E} +\ mathbf {v} \ times \ mathbf {B}.}$

Tato diferenciální rovnice je klasickou pohybovou rovnicí pro nabité částice . Spolu s počátečními podmínkami částice zcela určuje pohyb částice v prostoru a čase, pokud jde o m/Q . Hmotnostní spektrometry tedy lze považovat za „hmotnostní spektrometry“. Při prezentaci dat je běžné používat (oficiálně) bezrozměrné m/z , kde z je počet elementárních nábojů ( e ) na iontu (z = Q/e). Tato veličina, ačkoliv se neformálně nazývá poměr hmotnosti k náboji, přesněji řečeno představuje poměr hmotnostního čísla a čísla náboje, z .

Existuje mnoho typů hmotnostních analyzátorů, využívajících buď statická nebo dynamická pole, a magnetická nebo elektrická pole, ale všechna pracují podle výše uvedené diferenciální rovnice. Každý typ analyzátoru má své silné a slabé stránky. Mnoho hmotnostních spektrometrů používá dva nebo více hmotnostních analyzátorů pro tandemovou hmotnostní spektrometrii (MS/MS) . Kromě běžnějších hmotnostních analyzátorů uvedených níže existují ještě další určené pro zvláštní situace.

Existuje několik důležitých charakteristik analyzátoru. Výkonu k hmotnosti řešení je mírou schopnosti rozlišovat dva vrcholy mírně odlišné m / z . Přesnost hmotnosti je poměrem chyby měření m/z ke skutečnému m/z. Hmotnostní přesnost se obvykle měří v ppm nebo mililitrových hmotnostních jednotkách . Hmotnostní rozsah je rozsah m/z přístupný analýze daným analyzátorem. Lineární dynamický rozsah je rozsah, ve kterém je iontový signál lineární s koncentrací analytu. Rychlost se vztahuje k časovému rámci experimentu a nakonec se používá k určení počtu spekter za jednotku času, které lze vygenerovat.

Odvětvové nástroje

Hmotnostní analyzátor pole sektor používá statické elektrické a / nebo magnetické pole, aby vliv na dráhu a / nebo rychlost těchto nabitých částic v nějakým způsobem. Jak je uvedeno výše, sektorové nástroje ohýbají trajektorie iontů, když procházejí hmotnostním analyzátorem, podle jejich poměrů hmotnosti k náboji, více odklánějí nabitější a rychleji se pohybující, lehčí ionty. Analyzátor lze použít k výběru úzkého rozsahu m/z nebo ke skenování v rozsahu m/z ke katalogizaci přítomných iontů.

Čas letu

Time-of-flight (TOF) Analyzátor používá elektrické pole k urychlení iontů přes stejný potenciál , a pak měří čas, který byl zapotřebí k dosažení detektoru. Pokud mají všechny částice stejný náboj , jejich kinetické energie budou identické a jejich rychlosti budou záviset pouze na jejich hmotnosti . Ióny s nižší hmotností se k detektoru dostanou jako první. Ve skutečnosti však i částice se stejnou m/z mohou dorazit na detektor v různých časech, protože mají různé počáteční rychlosti. Počáteční rychlost často nezávisí na hmotnosti iontu TOF-MS a změní se na rozdíl v konečné rychlosti. Z tohoto důvodu ionty se stejným poměrem m/z dosáhnou detektoru v různých časech, což rozšíří píky zobrazené na grafu počet vs. m/z, ale obecně nezmění centrální umístění píků, protože průměrná počáteční rychlost iontů vzhledem k ostatním analyzovaným iontům je obecně soustředěna na nulu. Chcete-li tento problém vyřešit, bylo s TOF-MS spojeno zaostřování s časovým zpožděním/ zpožděná extrakce .

Hmotnostní filtr se čtyřmi póly

Čtyřpólové hmotnostní analyzátory využívají oscilační elektrická pole k selektivní stabilizaci nebo destabilizaci cest iontů procházejících radiofrekvenčním (RF) kvadrupólovým polem vytvořeným mezi čtyřmi rovnoběžnými tyčemi. Systémem procházejí kdykoli pouze ionty v určitém rozsahu poměru hmotnost/náboj, ale změny potenciálů na tyčích umožňují rychlé zametení širokého rozsahu hodnot m/z, a to buď nepřetržitě, nebo postupně diskrétní chmel. Čtyřpólový hmotnostní analyzátor funguje jako filtr pro výběr hmoty a je v těsném spojení s kvadrupólovým iontovým lapačem , zejména s lineárním kvadrupólovým iontovým pastem, kromě toho, že je navržen tak, aby procházel nezachycenými ionty spíše než sbíral ty zachycené, a proto je uveden jako přenosový čtyřpól. Magneticky vylepšený čtyřpólový hmotnostní analyzátor zahrnuje přidání magnetického pole, buď aplikovaného axiálně nebo příčně. Tento nový typ nástroje vede k dalšímu zvýšení výkonu, pokud jde o rozlišení a/nebo citlivost v závislosti na velikosti a orientaci aplikovaného magnetického pole. Běžnou variantou přenosového kvadrupólu je hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem. „Triple quad“ má tři po sobě jdoucí kvadrupólové stupně, přičemž první působí jako hmotnostní filtr pro přenos konkrétního přicházejícího iontu do druhého kvadrupólu, kolizní komory, kde lze tento ion rozbít na fragmenty. Třetí kvadrupól také funguje jako hmotnostní filtr pro přenos konkrétního fragmentového iontu do detektoru. Pokud je kvadrupól vyroben tak, aby rychle a opakovaně cykloval v rozsahu nastavení hmotnostního filtru, lze hlásit celá spektra. Podobně lze provést trojnásobnou čtyřkolku pro provádění různých typů skenování charakteristických pro tandemovou hmotnostní spektrometrii .

Iontové pasti

Trojrozměrná kvadrupólová iontová past

Iontová past kvadrupólové funguje na stejných fyzikálních principech jako hmotnostního analyzátoru kvadrupólové, ale ionty jsou zachyceny a postupně vysune. Iony jsou zachyceny v převážně kvadrupólovém vysokofrekvenčním poli v prostoru definovaném prstencovou elektrodou (obvykle připojenou k hlavnímu vysokofrekvenčnímu potenciálu) mezi dvěma koncovými elektrodami (obvykle připojenými ke stejnosměrným nebo pomocným střídavým potenciálům). Vzorek je ionizován buď interně (např. Elektronovým nebo laserovým paprskem), nebo externě, v takovém případě jsou ionty často zavedeny otvorem v koncové elektrodě.

Existuje mnoho metod separace a izolace hmoty/náboje, ale nejčastěji se používá režim nestability hmoty, ve kterém je RF potenciál zesílen tak, že oběžná dráha iontů s hmotností a > b je stabilní, zatímco ionty s hmotností b jsou nestabilní a jsou vysunutý na osu z na detektor. Existují také nedestruktivní analytické metody.

Ionty mohou být také vysunuty metodou rezonanční excitace, přičemž na koncové elektrody je aplikováno doplňkové oscilační budicí napětí a amplituda zachycovacího napětí a/nebo frekvence budicího napětí se mění, aby se ionty uvedly do rezonančního stavu v pořadí podle jejich hmotnosti/ poměr nabití.

Válcová iontová past

Hmotnostní spektrometr válcové iontovou pastí (CIT) je derivát iontové pasti kvadrupólové kde jsou elektrody vytvořené z plochých prstenců, spíše než hyperbolické tvarované elektrody. Architektura se dobře hodí k miniaturizaci, protože jak se zmenšuje velikost pasti, tvar elektrického pole poblíž středu pasti, oblasti, kde jsou zachyceny ionty, tvoří tvar podobný hyperbolické pasti.

Lineární kvadrupólový iontový past

Lineární kvadrupól iontová past je podobná iontové pasti kvadrupólové, ale pasti ionty ve dvourozměrné kvadrupólové pole, namísto trojrozměrného čtyřpólového pole jako na kvadrupólové iontové pasti 3D. Thermo Fisher's LTQ („lineární lapač čtyřpólů“) je příkladem lineární iontové pasti.

Toroidní iontovou past lze zobrazit jako lineární kvadrupól zakřivený kolem a spojený na koncích nebo jako průřez 3D iontovou pastí otočenou na hraně za vzniku toroidní pasty ve tvaru koblihy. Pasti mohou ukládat velké objemy iontů tím, že je distribuují po prstencové struktuře pasti. Tato toroidní past je konfigurace, která umožňuje zvýšenou miniaturizaci hmotnostního analyzátoru iontových pastí. Kromě toho jsou všechny ionty uloženy ve stejném záchytném poli a společně vyhozeny, což zjednodušuje detekci, což může být komplikované s konfiguracemi polí kvůli změnám v zarovnání detektoru a obrábění polí.

Lineární pasti a 3D kvadrupólové iontové pasti jsou stejně jako u toroidních pastí nejčastěji miniaturizovanými hmotnostními analyzátory kvůli jejich vysoké citlivosti, toleranci pro tlak mTorr a schopnostem tandemové hmotnostní spektrometrie s jedním analyzátorem (např. Skenování iontů produktu).

Orbitrap

Orbitrapové přístroje jsou podobné hmotnostním spektrometrům s Fourierovou transformací iontových cyklotronových rezonančních hmot (viz text níže). Ionty jsou elektrostaticky zachyceny na oběžné dráze kolem centrální elektrody ve tvaru vřetena. Elektroda omezuje ionty tak, že obě obíhají kolem centrální elektrody a kmitají tam a zpět podél dlouhé osy centrální elektrody. Tato oscilace generuje obrazový proud v detekčních deskách, který je zaznamenáván přístrojem. Frekvence těchto obrazových proudů závisí na poměrech hmotnosti a náboje iontů. Hmotnostní spektra jsou získána Fourierovou transformací zaznamenaných obrazových proudů.

Orbitrapy mají vysokou hmotnostní přesnost, vysokou citlivost a dobrý dynamický rozsah.

Cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací

Hmotnostní spektrometrie s Fourierovou transformací (FTMS), přesněji Fourierova transformace iontové cyklotronové rezonance MS, měří hmotnost detekováním proudu obrazu produkovaného cyklotronováním iontů za přítomnosti magnetického pole. Namísto měření vychýlení iontů detektorem, jako je elektronový multiplikátor , jsou ionty injektovány do Penningovy pasti (statická elektrická/magnetická iontová past ), kde účinně tvoří součást obvodu. Detektory v pevných polohách v prostoru měří elektrický signál iontů, které procházejí v jejich blízkosti v průběhu času a vytvářejí periodický signál. Vzhledem k tomu, že frekvence cyklování iontů je určena poměrem hmotnosti k náboji, lze to dekonvolutovat provedením Fourierovy transformace na signálu. FTMS má výhodu vysoké citlivosti (protože každý ion je „počítán“ více než jednou) a mnohem vyššího rozlišení a tím i přesnosti.

Iontová cyklotronová rezonance (ICR) je starší technika hromadné analýzy podobná FTMS s tím rozdílem, že ionty jsou detekovány tradičním detektorem. Iony uvězněné v Penningově pasti jsou buzeny vysokofrekvenčním elektrickým polem, dokud nenarazí na stěnu pasti, kde je umístěn detektor. Ionty různé hmotnosti jsou rozlišeny podle doby nárazu.

Detektory

Konečným prvkem hmotnostního spektrometru je detektor. Detektor zaznamenává buď indukovaný náboj, nebo proud vytvořený při průchodu iontu nebo dopadu na povrch. V skenovacím nástroji signál produkovaný v detektoru v průběhu skenování ve srovnání s místem, kde je nástroj ve skenování (v jakých m/Q ), vytvoří hmotnostní spektrum , záznam iontů jako funkce m/Q .

Obvykle se používá nějaký typ elektronového multiplikátoru , i když se používají i jiné detektory včetně Faradayových kelímků a detektorů iontů na fotony . Protože počet iontů opouštějících hmotnostní analyzátor v určitém okamžiku je obvykle poměrně malý, je pro získání signálu často nutné značné zesílení. Mikrokanálové detektory desek se běžně používají v moderních komerčních přístrojích. U FTMS a Orbitraps se detektor skládá z dvojice kovových povrchů v oblasti hmotnostního analyzátoru/iontové pasti, ke kterým ionty procházejí pouze při oscilaci. Nevytváří se žádný stejnosměrný proud, v obvodu mezi elektrodami se vytváří pouze slabý střídavý obrazový proud. Byly také použity jiné indukční detektory.

Tandemová hmotnostní spektrometrie

Tandemová hmotnostní spektrometr je schopen několika kolech hmotnostní spektrometrie, obvykle od sebe odděleny určitou formu molekuly fragmentace. Například jeden hmotnostní analyzátor může izolovat jeden peptid z mnoha vstupujících do hmotnostního spektrometru. Druhý hmotnostní analyzátor pak stabilizuje peptidové ionty, zatímco se sráží s plynem, což způsobí jejich fragmentaci disociací indukovanou kolizí (CID). Třetí hmotnostní analyzátor pak třídí fragmenty vyrobené z peptidů. Tandem MS lze také provádět v jednom hmotnostním analyzátoru v průběhu času, jako v kvadrupólové iontové pasti . Existují různé metody pro fragmentaci molekul pro tandemovou MS, včetně kolizí indukované disociace (CID), disociace elektronového záchytu (ECD), disociace přenosu elektronů (ETD), infračervená multipotonová disociace (IRMPD), infračervená radiační disociace černého tělesa (BIRD), elektron -disociační disociace (EDD) a povrchově indukovaná disociace (SID). Důležitou aplikací využívající tandemovou hmotnostní spektrometrii je identifikace proteinů .

Tandemová hmotnostní spektrometrie umožňuje řadu experimentálních sekvencí. Mnoho komerčních hmotnostních spektrometrů je navrženo tak, aby urychlilo provádění takových rutinních sekvencí, jako je monitorování vybraných reakcí (SRM) a skenování prekurzorových iontů. V SRM první analyzátor umožňuje průchod pouze jedné hmotnosti a druhý analyzátor monitoruje více uživatelem definovaných fragmentových iontů. SRM se nejčastěji používá u skenovacích přístrojů, kde je druhá událost hromadné analýzy omezena na pracovní cyklus . Tyto experimenty se používají ke zvýšení specificity detekce známých molekul, zejména ve farmakokinetických studiích. Skenování prekurzorových iontů se týká monitorování specifické ztráty z prekurzorového iontu. První a druhý hmotnostní analyzátor prohledávají celé spektrum jako rozdělené uživatelem definovanou hodnotou m/z . Tento experiment se používá k detekci specifických motivů v neznámých molekulách.

Dalším typem tandemové hmotnostní spektrometrie používané pro radiokarbonové datování je akcelerátorová hmotnostní spektrometrie (AMS), která používá velmi vysoká napětí, obvykle v megavoltovém rozsahu, k urychlení záporných iontů do typu tandemového hmotnostního spektrometru.

Databáze METLIN Metabolite and Chemical Entity Database je největším úložištěm experimentálních dat tandemové hmotnostní spektrometrie získávaných ze standardů. Údaje o tandemové hmotnostní spektrometrii na více než 850 000 molekulárních standardech (k 24. srpnu 2020) jsou poskytovány za účelem usnadnění identifikace chemických entit z experimentů tandemové hmotnostní spektrometrie. Kromě identifikace známých molekul je také užitečné pro identifikaci neznámých pomocí vyhledávání/analýzy podobnosti. Všechna data o tandemové hmotnostní spektrometrii pocházejí z experimentální analýzy standardů při více kolizních energiích a v pozitivním i negativním ionizačním režimu.

Běžné konfigurace a techniky hmotnostního spektrometru

Když se konkrétní kombinace zdroje, analyzátoru a detektoru stane v praxi běžnou, může vzniknout složená zkratka, která by ji lakonicky označila. Jedním z příkladů je MALDI-TOF , který odkazuje na kombinaci zdroje laserové desorpce/ionizace s maticovou asistencí a hmotnostního analyzátoru doby letu . Mezi další příklady patří hmotnostně spektrometrie s indukčně vázanou plazmou (ICP-MS) , hmotnostní spektrometrie s akcelerátorem (AMS) , hmotnostní spektrometrie s tepelnou ionizací (TIMS) a hmotnostní spektrometrie se zdrojem jisker (SSMS) .

Některé aplikace hmotnostní spektrometrie vyvinuly přezdívky, které, i když by se striktně vzato zdálo, odkazují na širokou aplikaci, v praxi místo toho přišly na konotaci konkrétního nebo omezeného počtu konfigurací nástrojů. Příkladem toho je hmotnostní spektrometrie s poměrem izotopů (IRMS), která v praxi odkazuje na použití omezeného počtu sektorových hmotnostních analyzátorů; tento název se používá k označení aplikace i nástroje použitého pro aplikaci.

Separační techniky kombinované s hmotnostní spektrometrií

Důležitým vylepšením schopností hmotnostní spektrometrie rozlišovat hmotnost a určovat hmotnost je používat ji společně s chromatografickými a jinými separačními technikami.

Plynová chromatografie

Běžnou kombinací je plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie (GC/MS nebo GC-MS). V této technice se k oddělení různých sloučenin používá plynový chromatograf . Tento proud separovaných sloučenin se přivádí online do iontového zdroje, kovového vlákna, na které je aplikováno napětí . Toto vlákno emituje elektrony, které ionizují sloučeniny. Ionty se pak mohou dále fragmentovat, čímž se získají předvídatelné vzorce. Neporušené ionty a fragmenty procházejí do analyzátoru hmotnostního spektrometru a jsou nakonec detekovány. Vysoké teploty (300 ° C) používané v injekčním portu (a peci) GC-MS však mohou mít za následek tepelnou degradaci injektovaných molekul, což má za následek měření degradačních produktů místo skutečné molekuly (molekul), o kterou je zájem.

Kapalinová chromatografie

Podobně jako plynová chromatografie MS (GC-MS), kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC/MS nebo LC-MS) odděluje sloučeniny chromatograficky před jejich zavedením do iontového zdroje a hmotnostního spektrometru. Liší se od GC-MS v tom, že mobilní fáze je kapalná, obvykle směs vody a organických rozpouštědel , místo plynu. V LC-MS se nejčastěji používá zdroj ionizace elektrosprejem . Další zajímavá a komerčně dostupné zdroje LC-MS iontové jsou za atmosférického tlaku chemická ionizace a atmosférickém tlaku fotoionizační . Existuje také několik nově vyvinutých ionizačních technik, jako je laserový sprej .

Kapilární elektroforéza - hmotnostní spektrometrie

Kapilární elektroforéza-hmotnostní spektrometrie (CE-MS) je technika, která kombinuje proces kapilární elektroforézy s kapalinovou separací s hmotnostní spektrometrií. CE-MS je obvykle spojen s ionizací elektrosprejem.

Mobilita iontů

Spektrometrie pohyblivosti iontů-hmotnostní spektrometrie (IMS/MS nebo IMMS) je technika, kde jsou ionty nejprve odděleny časem driftu přes nějaký neutrální plyn pod aplikovaným gradientem elektrického potenciálu, než jsou zavedeny do hmotnostního spektrometru. Drift time je míra poloměru vzhledem k náboji iontu. Pracovní cyklus IMS (doba, po kterou experiment probíhá) je delší než většina technik hmotnostní spektrometrie, takže hmotnostní spektrometr může vzorkovat v průběhu separace IMS. To produkuje data o separaci IMS a poměru hmotnosti k náboji iontů podobným způsobem jako LC-MS .

Pracovní cyklus IMS je krátký ve srovnání s kapalinovou chromatografií nebo separací plynovou chromatografií, a lze jej tedy spojit s takovými technikami, čímž se získají trojité modality, jako je LC/IMS/MS.

Data a analýza

Reprezentace dat

Hmotnostní spektrometrie produkuje různé typy dat. Nejběžnější reprezentací dat je hmotnostní spektrum .

Určité typy dat hmotnostní spektrometrie jsou nejlépe reprezentovány jako hmotnostní chromatogram . Typy chromatogramů zahrnují mimo jiné monitorování vybraných iontů (SIM), celkový iontový proud (TIC) a monitorování vybraných reakcí (SRM).

Jiné typy dat hmotnostní spektrometrie jsou dobře reprezentovány jako trojrozměrná vrstevnicová mapa . V této formě je hmotnost na náboj, m/z na ose x , intenzita osy y , a na z -ose je zaznamenán další experimentální parametr, jako je čas .

Analýza dat

Analýza dat hmotnostní spektrometrie je specifická pro typ experimentu produkující data. Obecná členění dat jsou zásadní pro porozumění jakýmkoli údajům.

Mnoho hmotnostních spektrometrů pracuje buď v režimu negativních iontů, nebo v režimu pozitivních iontů . Je velmi důležité vědět, zda jsou pozorované ionty nabité záporně nebo kladně. To je často důležité při určování neutrální hmotnosti, ale také to naznačuje něco o povaze molekul.

Různé typy iontových zdrojů mají za následek různá pole fragmentů produkovaných z původních molekul. Elektronový ionizační zdroj produkuje mnoho fragmentů a většinou jedno nabitých (1-) radikálů (lichý počet elektronů), zatímco zdroj elektrospreje obvykle produkuje neradikálové kvazimolekulární ionty, které jsou často mnohonásobně nabité. Tandemová hmotnostní spektrometrie záměrně produkuje fragmentové ionty post-source a může drasticky změnit druh dat dosažených experimentem.

Znalost původu vzorku může poskytnout vhled do složek molekul vzorku a jejich fragmentací. Vzorek z procesu syntézy/výroby bude pravděpodobně obsahovat nečistoty chemicky příbuzné cílové složce. Hrubě připravený biologický vzorek bude pravděpodobně obsahovat určité množství soli, která může při určitých analýzách tvořit adukty s molekulami analytu.

Výsledky mohou také do značné míry záviset na přípravě vzorku a na tom, jak byl spuštěn/zaveden. Důležitým příkladem je otázka, která matice se používá pro MALDI špinění, protože velká část energetiky události desorpce/ionizace je řízena maticí spíše než výkonem laseru. Někdy jsou vzorky obohaceny sodíkem nebo jinými druhy nesoucími ionty, aby se vytvořily adukty, a nikoli protonované druhy.

Hmotnostní spektrometrie může měřit molární hmotnost, molekulární strukturu a čistotu vzorku. Každá z těchto otázek vyžaduje jiný experimentální postup; adekvátní definice experimentálního cíle je proto předpokladem pro shromažďování správných dat a jejich úspěšnou interpretaci.

Interpretace hmotnostních spekter

Protože přesná struktura nebo peptidová sekvence molekuly je dešifrována sadou fragmentových hmot, interpretace hmotnostních spekter vyžaduje kombinované použití různých technik. Obvykle je první strategií identifikace neznámé sloučeniny srovnání jejího experimentálního hmotnostního spektra s knihovnou hmotnostních spekter. Pokud z vyhledávání nevyplynou žádné shody, musí být provedena ruční interpretace nebo softwarově asistovaná interpretace hmotnostních spekter . Počítačová simulace ionizačních a fragmentačních procesů vyskytujících se v hmotnostním spektrometru je primárním nástrojem pro přiřazování struktury nebo peptidové sekvence molekule. A priori strukturní informace jsou fragmentovány v silico a výsledný obrazec je porovnán s pozorovaným spektrem. Taková simulace je často podporována knihovnou fragmentací, která obsahuje publikované vzorce známých rozkladných reakcí. Software využívající této myšlenky byl vyvinut pro malé molekuly i proteiny .

Analýzou hmotnostních spekter mohou být také spektra s přesnou hmotností . Poměr hmotnosti k náboji ( m/z ) s pouze celočíselnou přesností může představovat ohromný počet teoreticky možných iontových struktur; přesnější údaje o hmotnosti však významně snižují počet kandidátních molekulárních vzorců . Počítačový algoritmus nazývaný generátor vzorců vypočítá všechny molekulární vzorce, které teoreticky odpovídají dané hmotnosti se stanovenou tolerancí.

Nedávná technika pro objasnění struktury v hmotnostní spektrometrii, nazývaná otisky prstů prekurzorových iontů , identifikuje jednotlivé části strukturní informace provedením vyhledávání tandemových spekter zkoumané molekuly proti knihovně spektra produktových iontů strukturně charakterizovaných prekurzorových iontů.

Aplikace

Hmotnostní spektrometrie má jak kvalitativní, tak kvantitativní využití. Patří sem identifikace neznámých sloučenin, stanovení izotopového složení prvků v molekule a určení struktury sloučeniny pozorováním její fragmentace. Mezi další použití patří kvantifikace množství sloučeniny ve vzorku nebo studium základů chemie iontů v plynné fázi (chemie iontů a neutrálů ve vakuu). MS se nyní běžně používá v analytických laboratořích, které studují fyzikální, chemické nebo biologické vlastnosti celé řady sloučenin.

Jako analytická technika má zřetelné výhody, jako jsou: Zvýšená citlivost oproti většině ostatních analytických technik, protože analyzátor jako filtr hromadného náboje snižuje rušení pozadí, vynikající specificita charakteristických fragmentačních vzorců k identifikaci neznámých nebo potvrzení přítomnosti podezřelých sloučenin, Informace o molekulové hmotnosti, Informace o izotopickém množství prvků, Dočasně vyřešená chemická data.

Několik nevýhod metody spočívá v tom, že často nerozlišuje mezi optickými a geometrickými izomery a polohami substituentu v polohách o-, m- a p- v aromatickém kruhu. Jeho rozsah je také omezený při identifikaci uhlovodíků, které produkují podobné fragmentované ionty.

Poměr izotopů MS: izotopové datování a trasování

Hmotnostní spektrometrie se také používá ke stanovení izotopového složení prvků ve vzorku. Rozdíly v hmotnosti mezi izotopy prvku jsou velmi malé a méně hojné izotopy prvku jsou obvykle velmi vzácné, proto je zapotřebí velmi citlivý nástroj. Tyto přístroje, někdy označované jako hmotnostní spektrometry s poměrem izotopů (IR-MS), obvykle používají jediný magnet k ohnutí svazku ionizovaných částic směrem k sérii Faradayových pohárků, které převádějí dopady částic na elektrický proud . Rychlou on-line analýzu obsahu deuteria ve vodě lze provést pomocí hmotnostní spektrometrie s tekoucí dosvitem , FA-MS. Pravděpodobně nejcitlivějším a nejpřesnějším hmotnostním spektrometrem pro tento účel je hmotnostní spektrometr s akcelerátorem (AMS). Je to proto, že poskytuje maximální citlivost, schopnou měřit jednotlivé atomy a měřit nuklidy s dynamickým rozsahem ~ 10 ¹⁵ vzhledem k hlavnímu stabilnímu izotopu. Poměry izotopů jsou důležitými markery různých procesů. Některé poměry izotopů se používají ke stanovení stáří materiálů, například při datování uhlíkem . Pro kvantifikaci proteinů se také používá značení stabilními izotopy. (viz charakteristika bílkovin níže)

Membránová úvodní hmotnostní spektrometrie: měření plynů v roztoku

Membránová úvodní hmotnostní spektrometrie kombinuje poměr izotopů MS s reakční komorou/buňkou oddělenou membránou propustnou pro plyn. Tato metoda umožňuje studium plynů, které se vyvíjejí v roztoku. Tato metoda byla široce používána pro studium produkce kyslíku systémem Photosystem II .

Analýza stopových plynů

Několik technik používá ionty vytvořené ve vyhrazeném iontovém zdroji vstřikovaném do průtokové trubice nebo driftové trubice: zvolená iontová průtoková trubice (SIFT-MS) a reakce přenosu protonu (PTR-MS) jsou varianty chemické ionizace určené pro analýzu stopových plynů prostoru vzduchu, dechu nebo kapaliny pomocí dobře definované reakční doby umožňující výpočty koncentrací analytu ze známé reakční kinetiky bez potřeby vnitřního standardu nebo kalibrace.

Další technikou s aplikacemi v oblasti analýzy stopových plynů je sekundární elektrosprejová ionizace (SESI-MS), což je varianta elektrosprejové ionizace . SESI se skládá z elektrospreje čistého okyseleného rozpouštědla, které interaguje s neutrálními parami. Molekuly par se ionizují za atmosférického tlaku, když je náboj přenesen z iontů vytvořených v elektrospreji do molekul. Jednou z výhod tohoto přístupu je, že je kompatibilní s většinou systémů ESI-MS.

Atomová sonda

Sonda atom je nástroj, který kombinuje time-of-flight hmotnostní spektrometrie a pole-odpařování mikroskopie pro mapování lokalizace jednotlivých atomů.

Farmakokinetika

Farmakokinetika je často studována pomocí hmotnostní spektrometrie kvůli složité povaze matrice (často krve nebo moči) a potřebě vysoké citlivosti pro pozorování údajů o nízké dávce a dlouhém časovém bodu. Nejběžnější přístrojovou technikou používanou v této aplikaci je LC-MS s trojitým kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem . Pro přidanou specificitu se obvykle používá tandemová hmotnostní spektrometrie. Ke kvantifikaci obvykle jednoho léčiva ve vzorcích se používají standardní křivky a vnitřní standardy. Vzorky představují různé časové body, když se podává léčivo a poté se metabolizuje nebo se odstraňuje z těla. Prázdné vzorky nebo vzorky t = 0 odebrané před podáním jsou důležité pro určení pozadí a zajištění integrity dat s tak složitými matricemi vzorků. Velká pozornost je věnována linearitě standardní křivky; nicméně není neobvyklé používat křivky s komplexnějšími funkcemi, jako jsou kvadratické, protože odezva většiny hmotnostních spektrometrů je ve velkých koncentračních rozsazích menší než lineární.

V současné době existuje značný zájem o použití hmotnostní spektrometrie s velmi vysokou citlivostí pro studie mikrodávkování , které jsou považovány za slibnou alternativu k experimentům na zvířatech .

Nedávné studie ukazují, že sekundární elektrosprejová ionizace (SESI) je účinná technika ke sledování kinetiky léčiv pomocí dechové analýzy. Protože dech je produkován přirozeně, lze snadno shromáždit několik datových bodů. To umožňuje výrazně zvýšit počet shromážděných datových bodů. Ve studiích na zvířatech může tento přístup SESI snížit obětování zvířat. U lidí může neinvazivní dechová analýza SESI-MS pomoci studovat kinetiku léků na personalizované úrovni.

Charakterizace proteinů

Hmotnostní spektrometrie je důležitou metodou pro charakterizaci a sekvenování proteinů. Dvě primární metody ionizace celých proteinů jsou elektrosprejová ionizace (ESI) a matricově asistovaná laserová desorpce/ionizace (MALDI). V souladu s výkonem a hmotnostním rozsahem dostupných hmotnostních spektrometrů se pro charakterizaci proteinů používají dva přístupy. V prvním jsou intaktní proteiny ionizovány některou ze dvou výše popsaných technik a poté zavedeny do hmotnostního analyzátoru. Tento přístup se označuje jako strategie proteinové analýzy „ shora dolů “. Přístup shora dolů je však do značné míry omezen na nízkoprůchodové studie s jedním proteinem. Ve druhém jsou proteiny enzymaticky štěpeny na menší peptidy pomocí proteáz, jako je trypsin nebo pepsin , buď v roztoku nebo v gelu po elektroforetické separaci. Používají se také další proteolytická činidla. Sběr peptidových produktů se často odděluje chromatografií před zavedením do hmotnostního analyzátoru. Pokud se pro identifikaci proteinu použije charakteristický vzor peptidů, nazývá se metoda peptidovým hmotnostním otiskem prstu (PMF), pokud se identifikace provádí pomocí sekvenčních dat určených v tandemové MS analýze, nazývá se de novo sekvenování peptidů . Tyto postupy proteinové analýzy se také označují jako přístup „ zdola nahoru “ a byly také použity k analýze distribuce a polohy posttranslačních modifikací, jako je fosforylace na proteinech. Začíná se také používat třetí přístup, tento přechodný přístup „uprostřed dolů“ zahrnuje analýzu proteolytických peptidů, které jsou větší než typický tryptický peptid.

Průzkum vesmíru

Jako standardní metoda pro analýzu dosáhly hmotnostní spektrometry jiných planet a měsíců. Dva byli převezeni do Marsu pomocí programu Viking . Počátkem roku 2005 doručila mise Cassini – Huygens specializovaný přístroj GC-MS na palubu sondy Huygens atmosférou Titanu , největšího měsíce planety Saturn . Tento přístroj analyzoval atmosférické vzorky po sestupné trajektorii a po přistání sondy byl schopen odpařit a analyzovat vzorky zmrzlého povrchu Titanu pokrytého uhlovodíky. Tato měření porovnávají množství izotopů každé částice ve srovnání s přirozeným výskytem Země. Na palubě kosmické lodi Cassini -Huygens byl také iontový a neutrální hmotnostní spektrometr, který prováděl měření atmosférického složení Titanu i složení oblaků Encelada . Thermal a Evolved Gas Analyzer hmotnostní spektrometr byl nesen na Mars Phoenix Lander zahájen v roce 2007.

Hmotnostní spektrometry jsou také široce používány ve vesmírných misích k měření složení plazmatu. Sonda Cassini například nesla plazmový spektrometr Cassini (CAPS), který měřil hmotnost iontů v magnetosféře Saturnu .

Monitor vydechovaného plynu

Hmotnostní spektrometry byly použity v nemocnicích pro analýzu dýchacích plynů od roku 1975 do konce století. Některé jsou pravděpodobně stále používány, ale žádné se v současné době nevyrábí.

Nacházeli se většinou na operačním sále a byli součástí komplexního systému, ve kterém byly do přístroje nasávány vzorky dýchaného plynu od pacientů podstupujících anestezii prostřednictvím ventilového mechanismu určeného k postupnému připojení až 32 místností k hmotnostnímu spektrometru. Počítač řídil všechny operace systému. Data shromážděná z hmotnostního spektrometru byla dodána do jednotlivých místností k použití anesteziologovi.

Jedinečnost tohoto hmotnostního spektrometru magnetického sektoru mohla být skutečnost, že rovina detektorů, z nichž každý byl záměrně umístěn tak, aby sbíral všechny druhy iontů, u nichž se očekává, že budou ve vzorcích, umožňovala přístroji současně hlásit všechny plyny dýchané pacientem . Přestože byl hmotnostní rozsah omezen na mírně přes 120 u , fragmentace některých těžších molekul negovala potřebu vyššího detekčního limitu.

Preparativní hmotnostní spektrometrie

Primární funkcí hmotnostní spektrometrie je nástroj pro chemické analýzy založené na detekci a kvantifikaci iontů podle jejich poměru hmotnosti k náboji. Hmotnostní spektrometrie však také slibuje syntézu materiálu. Měkké přistání iontů je charakterizováno ukládáním neporušených druhů na povrchy při nízkých kinetických energiích, což vylučuje fragmentaci dopadajících druhů. Technika měkkého přistání byla poprvé popsána v roce 1977 pro reakci nízkoenergetických iontů obsahujících síru na povrchu olova.

Viz také

Reference

Bibliografie

externí odkazy

Knihovní zdroje o hmotnostní spektrometrii

Zdroje ve vaší knihovně Zdroje v jiných knihovnách

• Hmotnostní spektrometrie v Curlie
• Interaktivní výukový program o hmotnostních spektrech National High Magnetic Field Laboratory
• Simulace hmotnostního spektrometru Interaktivní aplikace simulující konzolu hmotnostního spektrometru
• Realtime Mass Spectra simulation Tool pro simulaci hmotnostních spekter v prohlížeči