Mikroinjekce - Microinjection
Mikroinjekce je použití skleněné mikropipety k vstřikování kapalné látky na mikroskopické nebo hraniční makroskopické úrovni. Cíl je často živá buňka, ale může také zahrnovat mezibuněčný prostor. Mikroinjekce je jednoduchý mechanický proces, který obvykle zahrnuje invertovaný mikroskop se zvětšením přibližně 200x (i když někdy se provádí pomocí pitevního stereoskopického mikroskopu při 40–50x nebo tradičním složeným vzpřímeným mikroskopem při podobné síle jako obrácený model).
U procesů, jako je buněčná nebo nukleární injekce, je cílová buňka umístěna pod mikroskopem a dva mikromanipulátory - jeden drží pipetu a jeden drží mikrokapilární jehlu o průměru obvykle mezi 0,5 a 5 μm (větší, pokud se injekčně podávají kmenové buňky do embrya) - slouží k proniknutí do buněčné membrány a / nebo jaderného obalu . Tímto způsobem lze postup použít k zavedení vektoru do jedné buňky. Mikroinjekce mohou být také použity v klonování organismů, ve studiu buněčné biologie a viry, a pro léčbu mužské subfertility přes intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI, / ɪ k s i / IK -viz ).
Dějiny
Použití mikroinjekce jako biologického postupu začalo na počátku dvacátého století, ačkoli ani v 70. letech nebylo běžně používáno. V 90. letech jeho použití významně eskalovalo a je nyní považováno za běžnou laboratorní techniku spolu s fúzí vezikul , elektroporací , chemickou transfekcí a virovou transdukcí pro zavedení malého množství látky do malého cíle.
Základní typy
Existují dva základní typy mikroinjekčních systémů. První se nazývá systém s konstantním průtokem a druhý se nazývá systém s pulzním tokem . V systému s konstantním průtokem, který je relativně jednoduchý a levný, i když neohrabaný a zastaralý, se z mikropipety dodává konstantní tok vzorku a množství vzorku, který se vstřikuje, se určuje podle toho, jak dlouho jehla zůstane v buňce. Tento systém obvykle vyžaduje zdroj regulovaného tlaku, kapilární držák a buď hrubý nebo jemný mikromanipulátor. Systém pulzního průtoku však umožňuje větší kontrolu a konzistenci nad množstvím injikovaného vzorku: nejběžnější uspořádání pro intracytoplazmatickou injekci spermií zahrnuje injektor Eppendorf „Femtojet“ spojený s Eppendorf „InjectMan“, i když postupy zahrnující jiné cíle obvykle vyžadují výhoda mnohem levnějšího zařízení podobné schopnosti. Díky své zvýšené kontrole nad umístěním a pohybem jehly a kromě zvýšené přesnosti nad objemem dodané látky vede technika pulzního toku obvykle k menšímu poškození přijímací buňky než technika konstantního toku. Řada Eppendorf však má přinejmenším složité uživatelské rozhraní a její jednotlivé součásti systému jsou obvykle mnohem dražší než ty, které jsou nutné k vytvoření systému s konstantním průtokem, nebo než jiné systémy se vstřikováním pulzního toku.
Nukleární injekce
Prunukleární injekce je technika používaná k vytváření transgenních organismů vstřikováním genetického materiálu do jádra oplodněného oocytu . Tato technika se běžně používá ke studiu role genů pomocí zvířecích modelů myší.
Pronukleární injekce u myší
Pronukleární injekce myších spermií je jedním ze dvou nejběžnějších způsobů produkce transgenních zvířat (spolu s genetickým inženýrstvím embryonálních kmenových buněk ). Aby mohla být nukleární injekce úspěšná, musí být injekčně podán genetický materiál (obvykle lineární DNA ), zatímco genetický materiál z oocytů a spermií je oddělen (tj. Předjaderná fáze ). Za účelem získání těchto oocytů se myši obvykle superovulují pomocí gonadotropinů . Jakmile dojde k ucpání , oocyty se sklidí z myši a injikují se do ní genetický materiál. Oocyt je pak implantuje do vejcovodu části pseudogravidní zvířete . I když se účinnost liší, 10-40% myší narozených z těchto implantovaných oocytů může obsahovat injikovaný konstrukt . Transgenní myši pak mohou být chovány k vytvoření transgenních linií.