Mikrosatelit - Microsatellite

Tento článek je o sekvenci DNA. Pro malé kosmické lodě na oběžné dráze viz Microsatellite (vesmírný let) .

Mikrosatelit je trakt repetitivní DNA, ve kterém byly některé DNA motivy (v rozsahu délky od jednoho do šesti nebo více párů bází ) se opakují, typicky 5-50 krát. Mikrosatelity se vyskytují na tisících místech v genomu organismu . Mají vyšší míru mutací než jiné oblasti DNA, což vede k vysoké genetické rozmanitosti . Mikrosatelity jsou forenzními genetiky často označovány jako krátké tandemové repetice ( STR ) a v genetické genealogii nebo rostlinnými genetiky jako opakování jednoduchých sekvencí ( SSR ).

Mikrosatelity a jejich delší bratranci, minisatelity , jsou společně klasifikovány jako VNTR (variabilní počet tandemových opakování ) DNA. Název „satelitní“ DNA označuje časné pozorování, že centrifugace genomové DNA ve zkumavce odděluje prominentní vrstvu hromadné DNA od doprovodných „satelitních“ vrstev opakující se DNA.

Jsou široce používány pro profilování DNA při diagnostice rakoviny , při analýze příbuznosti (zejména testování otcovství ) a při forenzní identifikaci. Používají se také při analýze genetických vazeb k lokalizaci genu nebo mutace odpovědné za daný znak nebo onemocnění. Mikrosatelity se také používají v populační genetice k měření úrovní příbuznosti mezi poddruhy, skupinami a jednotlivci.

Dějiny

Ačkoli první mikrosatelit charakterizovali v roce 1984 na univerzitě v Leicesteru Weller, Jeffreys a kolegové jako polymorfní GGAT repetici v genu pro lidský myoglobin, termín „mikrosatelit“ zavedli později, v roce 1989, Litt a Luty. Název „satelitní“ DNA označuje časné pozorování, že centrifugace genomové DNA ve zkumavce odděluje prominentní vrstvu hromadné DNA od doprovodných „satelitních“ vrstev opakující se DNA. Rostoucí dostupnost amplifikace DNA pomocí PCR na začátku 90. let spustila velké množství studií využívajících amplifikaci mikrosatelitů jako genetických markerů pro soudní lékařství, pro testování otcovství a pro poziční klonování za účelem nalezení genu, který je základem znaku nebo nemoci. Mezi prominentní rané aplikace patří mikrosatelitní genotypizace identifikace osm let starých kosterních pozůstatků britské oběti vraždy (Hagelberg et al. 1991) a lékaře koncentračního tábora v Osvětimi Josefa Mengeleho, který po druhé světové válce uprchl do Jižní Ameriky ( Jeffreys a kol., 1992).

Struktury, umístění a funkce

Mikrosatelit je trakt tandemově se opakujících (tj. Sousedních) motivů DNA, které se pohybují v délce od jednoho do šesti nebo až deseti nukleotidů (přesná definice a vymezení na delší minisatelity se liší od autora k autorovi) a obvykle se opakují 5– 50krát. Například sekvence TATATATATA je dinukleotidový mikrosatelit a GTCGTCGTCGTCGTC je trinukleotidový mikrosatelit (kde A je adenin , G guanin , C cytosin a T thymin ). Opakující se jednotky čtyř a pěti nukleotidů se označují jako tetra- a pentanukleotidové motivy. Většina eukaryot má mikrosatelity, s výraznou výjimkou některých druhů kvasinek. Mikrosatelity jsou distribuovány po celém genomu. Lidský genom například obsahuje 50 000–100 000 dinukleotidových mikrosatelitů a menší počet tri-, tetra- a pentanukleotidových mikrosatelitů. Mnoho z nich se nachází v nekódujících částech lidského genomu, a proto neprodukují proteiny, ale mohou být také umístěny v regulačních oblastech a kódujících oblastech .

Mikrosatelity v nekódujících oblastech nemusí mít žádnou konkrétní funkci, a proto nemusí být vybrány proti; to jim umožňuje akumulovat mutace bez překážek v průběhu generací a vede k variabilitě, kterou lze použít pro účely otisků prstů a identifikace DNA. Jiné mikrosatelity se nacházejí v regulačních lemujících nebo intronických oblastech genů nebo přímo v kodonech genů - mikrosatelitní mutace v takových případech mohou vést k fenotypovým změnám a chorobám, zejména u onemocnění způsobujících expanzi tripletů, jako je křehký X syndrom a Huntingtonova choroba .

Tyto telomery na koncích chromozomů, předpokládá, že se podílí na stárnutí / stárnutí , se skládají z repetitivních s hexanucleotide opakování motivu TTAGGG u obratlovců. Jsou tedy klasifikovány jako minisatelity . Podobně má hmyz ve svých telomerách kratší opakující se motivy, které lze pravděpodobně považovat za mikrosatelity.

Mechanismy mutace a rychlosti mutací

Klouzání řetězce DNA během replikace lokusu STR. Krabice symbolizují opakující se jednotky DNA. Šipky označují směr, ve kterém se replikuje nový řetězec DNA (bílé rámečky) z templátového vlákna (černé rámečky). Jsou znázorněny tři situace během replikace DNA. (a) Replikace lokusu STR proběhla bez mutace. (b) Replikace lokusu STR vedla ke zisku jedné jednotky díky smyčce v novém řetězci; aberantní smyčka je stabilizována lemujícími jednotkami komplementárními s opačným vláknem. (c) Replikace lokusu STR vedla ke ztrátě jedné jednotky v důsledku smyčky v řetězci šablony. (Forster et al., 2015)

Na rozdíl od bodových mutací , které ovlivňují pouze jeden nukleotid, mikrosatelitní mutace vedou k zisku nebo ztrátě celé jednotky opakování a někdy i dvou nebo více opakování současně. Očekává se tedy, že rychlost mutace v mikrosatelitních lokusech se bude lišit od jiných rychlostí mutací, jako jsou rychlosti substituce bází. Diskutuje se o skutečné příčině mutací v mikrosatelitech.

Jednou z navrhovaných příčin takových změn délky je skluz replikace, způsobený nesouladem mezi řetězci DNA při replikaci během meiózy. DNA polymeráza , enzym zodpovědný za čtení DNA během replikace, může sklouznout při pohybu podél řetězce templátu a pokračovat ve špatném nukleotidu. K prokluzu DNA polymerázy dochází častěji při replikaci repetitivní sekvence (jako je CGCGCG). Protože mikrosatelity obsahují takovéto opakující se sekvence, může DNA polymeráza v těchto sekvenčních oblastech dělat chyby vyšší rychlostí. Několik studií našlo důkaz, že skluz je příčinou mikrosatelitních mutací. K prokluzu v každém mikrosatelitu obvykle dochází přibližně jednou za 1 000 generací. Změny skluzu v opakující se DNA jsou tedy o tři řády běžnější než bodové mutace v jiných částech genomu. Většina skluzu má za následek změnu pouze jedné opakovací jednotky a rychlosti prokluzu se liší pro různé délky alel a velikosti opakujících se jednotek a v rámci různých druhů. Pokud je mezi jednotlivými alelami velký velikostní rozdíl, pak může dojít ke zvýšené nestabilitě při rekombinaci při meióze.

Další možnou příčinou mikrosatelitních mutací jsou bodové mutace, kdy je během replikace nesprávně kopírován pouze jeden nukleotid. Studie porovnávající lidské a primátové genomy zjistila, že většina změn v počtu opakování v krátkých mikrosatelitech se objevuje spíše v důsledku bodových mutací než skluzu.

Míra mikrosatelitních mutací

Míra mikrosatelitních mutací se liší podle polohy základny vzhledem k mikrosatelitu, typu opakování a identitě báze. Míra mutace konkrétně stoupá s počtem opakování, vrcholí kolem šesti až osmi opakování a poté opět klesá. Zvýšená heterozygotnost v populaci také zvýší míru mikrosatelitních mutací, zvláště když je mezi alelami velký délkový rozdíl. To je pravděpodobně způsobeno homologními chromozomy s rameny nestejných délek, které způsobují nestabilitu během meiózy.

Přímé odhady rychlosti mikrosatelitních mutací byly provedeny v mnoha organismech, od hmyzu po člověka. V kobylce pouštní Schistocerca gregaria byla míra mikrosatelitních mutací odhadována na 2,1 x 10-4 na generaci na lokus. Míra mikrosatelitních mutací v lidských zárodečných liniích samců je pětkrát až šestkrát vyšší než v zárodečných liniích samic a pohybuje se od 0 do 7 x 10 −3 na lokus na gametu na generaci. U hlístice Pristionchus pacificus se odhadovaná míra mikrosatelitních mutací pohybuje od 8,9 × 10–5 do 7,5 × 10–4 na lokus za generaci.

Biologické efekty mikrosatelitních mutací

Mnoho mikrosatelitů se nachází v nekódující DNA a jsou biologicky tiché. Jiné se nacházejí v regulační nebo dokonce kódující DNA - mikrosatelitní mutace v takových případech mohou vést k fenotypovým změnám a chorobám. Studie v celém genomu odhaduje, že mikrosatelitní variace přispívá 10–15% variací dědičné genové exprese u lidí.

Účinky na bílkoviny

U savců obsahuje 20% až 40% proteinů opakující se sekvence aminokyselin kódovaných opakováním krátkých sekvencí. Většina opakování krátkých sekvencí v genomových částech kódujících proteiny má opakující se jednotku tří nukleotidů, protože tato délka při mutaci nezpůsobí posun rámce. Každá trinukleotidová opakující se sekvence je transkribována do opakující se řady stejné aminokyseliny. V kvasinkách jsou nejčastějšími opakovanými aminokyselinami glutamin, kyselina glutamová, asparagin, kyselina asparagová a serin.

Mutace v těchto opakujících se segmentech mohou ovlivnit fyzikální a chemické vlastnosti proteinů s potenciálem vytvářet postupné a předvídatelné změny v působení proteinů. Například změny délky v tandemově se opakujících oblastech v genu Runx2 vedou k rozdílům v délce obličeje u domestikovaných psů ( Canis familiaris ), se spojením mezi delší délkou sekvence a delší tváří. Toto sdružení platí také pro širší škálu druhů masožravců. Změny délky v polyalaninových traktech v genu HoxA13 jsou spojeny s syndromem Hand-Foot-Genital Syndrome , vývojovou poruchou u lidí. Změny délky v jiných tripletových opakováních jsou spojeny s více než 40 neurologickými chorobami u lidí, zejména s chorobami expanze tripletů, jako je syndrom křehkého X a Huntingtonova choroba . K evolučním změnám z replikačního skluzu dochází také u jednodušších organismů. Například změny délky mikrosatelitů jsou běžné v proteinech povrchové membrány v kvasinkách, což zajišťuje rychlou evoluci vlastností buněk. Konkrétně změny délky v genu FLO1 řídí úroveň adheze k substrátům. Opakování krátkých sekvencí také poskytuje rychlou evoluční změnu povrchových proteinů v patogenních bakteriích; to jim může umožnit držet krok s imunologickými změnami v jejich hostitelích. Změny délky v krátkých sekvenčních opakováních u houby ( Neurospora crassa ) řídí trvání cyklů cirkadiánních hodin .

Účinky na genovou regulaci

Změny délky mikrosatelitů v promotorech a dalších cis-regulačních oblastech mohou rychle změnit genovou expresi mezi generacemi. Lidský genom obsahuje mnoho (> 16 000) opakování krátkých sekvencí v regulačních oblastech, které poskytují „ladicí knoflíky“ pro expresi mnoha genů.

Změny délky v bakteriálních SSR mohou ovlivnit tvorbu fimbrií u Haemophilus influenzae změnou rozestupu promotoru. Mikrosatelity dinukleotidů jsou spojeny s hojnými variacemi v cis-regulačních kontrolních oblastech v lidském genomu. Mikrosatelity v kontrolních oblastech genu receptoru vasopresinu 1a u hrabošů ovlivňují jejich sociální chování a úroveň monogamie.

U Ewingova sarkomu (typ bolestivé rakoviny kostí u mladých lidí) vytvořila bodová mutace rozšířený mikrosatelit GGAA, který váže transkripční faktor, který zase aktivuje gen EGR2, který rakovinu řídí. Kromě toho mohou jiné mikrosatelity GGAA ovlivnit expresi genů, které přispívají ke klinickému výsledku pacientů s Ewingovým sarkomem.

Účinky v intronech

Mikrosatelity uvnitř intronů také ovlivňují fenotyp prostřednictvím prostředků, které v současné době nejsou známy. Například se zdá, že expanze tripletu GAA v prvním intronu genu X25 interferuje s transkripcí a způsobuje Friedreichovu ataxii . Tandemové repetice v prvním intronu genu Asparagin syntetázy jsou spojeny s akutní lymfoblastickou leukémií. Opakovaný polymorfismus ve čtvrtém intronu genu NOS3 je spojen s hypertenzí v tuniské populaci. Zkrácené délky opakování v genu EGFR jsou spojeny s osteosarkomy.

O archaické formě sestřihu zachované v Zebrafish je známo, že používá mikrosatelitní sekvence v intronové mRNA pro odstranění intronů v nepřítomnosti U2AF2 a dalších spojovacích strojů. Předpokládá se, že tyto sekvence vytvářejí vysoce stabilní konfigurace čtyřlístku, které přinášejí 3 'a 5' intronová místa sestřihu do těsné blízkosti, což účinně nahrazuje spliceosom . Předpokládá se, že tento způsob sestřihu RNA se lišil od lidské evoluce při tvorbě tetrapodů a představoval artefakt světa RNA .

Účinky v rámci transpozonů

Téměř 50% lidského genomu je obsaženo v různých typech transponovatelných prvků (nazývaných také transpozony nebo „skákající geny“) a mnoho z nich obsahuje opakující se DNA. Je pravděpodobné, že se na regulaci genové exprese podílejí i opakování krátkých sekvencí v těchto místech.

Aplikace

Mikrosatelity se používají k hodnocení delecí chromozomální DNA při diagnostice rakoviny. Mikrosatelity jsou široce používány pro profilování DNA , také známé jako „genetické otisky prstů“, na skvrnách kriminality (ve forenzní oblasti) a tkáních (u pacientů po transplantaci). Jsou také široce používány v analýze příbuznosti (nejčastěji v testování otcovství). Mikrosatelity se také používají k mapování míst v genomu, konkrétně v analýze genetických vazeb k lokalizaci genu nebo mutace odpovědné za daný znak nebo onemocnění. Jako zvláštní případ mapování mohou být použity pro studie genové duplikace nebo delece . Výzkumníci používají mikrosatelity v populační genetice a v projektech na ochranu druhů. Rostlinní genetici navrhli použití mikrosatelitů pro selekci žádoucích znaků při šlechtění asistované markery .

Diagnóza rakoviny

V nádorových buňkách, jejichž kontrola replikace je poškozena, mohou být mikrosatelity získány nebo ztraceny obzvláště vysokou frekvencí během každého kola mitózy . Nádorová buněčná linie proto může vykazovat odlišný genetický otisk prstu než hostitelská tkáň a zejména u kolorektálního karcinomu se může projevovat ztrátou heterozygotnosti . Mikrosatelity se proto běžně používají v diagnostice rakoviny k hodnocení progrese nádoru.

Částečný profil lidského STR získaný pomocí soupravy Applied Biosystems Identifiler

Forenzní a lékařské otisky prstů

Mikrosatelitní analýza se stala populární v oblasti kriminalistiky v 90. letech minulého století. Používá se pro genetické snímání otisků prstů jednotlivců, kde to umožňuje forenzní identifikaci (typicky přiřazení kriminální skvrny oběti nebo pachateli). Používá se také k sledování pacientů po transplantaci kostní dřeně .

Mikrosatelity, které se dnes používají pro forenzní analýzu, jsou všechny tetra- nebo penta-nukleotidové opakování, protože poskytují vysoký stupeň bezchybných dat a jsou dostatečně krátké, aby přežily degradaci v neideálních podmínkách. I kratší sekvence opakování by měly tendenci trpět artefakty, jako je koktání PCR a preferenční amplifikace, zatímco delší sekvence opakování by více trpěly degradací životního prostředí a méně dobře by se amplifikovaly pomocí PCR . Další forenzní úvaha je, že musí být respektováno lékařské soukromí osoby , aby byly vybrány forenzní STR, které jsou nekódující, neovlivňují regulaci genů a nejsou obvykle trinukleotidovými STR, které by mohly být zapojeny do onemocnění expanze tripletů, jako je Huntingtonova choroba . Forenzní profily STR jsou uloženy v databázích DNA, jako je britská národní databáze DNA (NDNAD), americký CODIS nebo australský NCIDD.

Analýza příbuznosti (testování otcovství)

Autosomální mikrosatelity jsou široce používány pro profilování DNA při analýze příbuznosti (nejčastěji při testování otcovství). V genealogickém testování DNA se často používají otcovsky zděděné Y-STR (mikrosatelity na chromozomu Y ) .

Analýza genetické vazby

V průběhu devadesátých let a prvních několika let tohoto tisíciletí byly mikrosatelity pracovními koňskými genetickými markery pro skeny v celém genomu za účelem lokalizace jakéhokoli genu zodpovědného za daný fenotyp nebo nemoc pomocí pozorování segregace napříč generacemi vzorků rodokmenu. Ačkoli vzestup vyšší propustnosti a nákladově efektivních platforem jednonukleotidového polymorfismu (SNP) vedl k éře SNP pro skenování genomu, mikrosatelity zůstávají vysoce informativními měřítky genomové variace pro studie vazby a asociace. Jejich pokračující výhoda spočívá v jejich větší alelické diverzitě než biallelické SNP, takže mikrosatelity mohou diferencovat alely v rámci požadovaného nerovnovážného bloku vazeb definovaného SNP. Mikrosatelity tedy úspěšně vedly k objevům genů diabetu 2. typu (TCF7L2) a karcinomu prostaty (oblast 8q21).

Populační genetika

Konsensuální sousední strom 249 lidských populací a šesti populací šimpanzů. Vytvořeno na základě 246 mikrosatelitních markerů.

Mikrosatelity byly popularizovány v populační genetice v devadesátých letech, protože jak se PCR stala v laboratořích všudypřítomnou, výzkumníci byli schopni navrhnout primery a zesílit sady mikrosatelitů za nízké náklady. Jejich využití je široké. Mikrosatelit s neutrální evoluční historií jej činí použitelným pro měření nebo odvozování úzkých míst , lokální adaptace , indexu alelické fixace (F ST ), velikosti populace a toku genů . Jak se sekvenování příští generace stává dostupnějším, používání mikrosatelitů se snížilo, nicméně zůstávají zásadním nástrojem v této oblasti.

Pěstování rostlin

Marker assisted selection or marker aided selection (MAS) je nepřímý selekční proces, kde je sledovaný znak vybrán na základě markeru ( morfologické , biochemické nebo DNA / RNA variace) spojeného se zvláštním znakem (např. Produktivita, odolnost vůči chorobám, stres tolerance a kvality), spíše než na samotném znaku. Byly navrženy mikrosatelity, které mají být použity jako takové markery k podpoře šlechtění rostlin.

Analýza

Opakující se DNA nelze snadno analyzovat metodami sekvenování DNA příští generace , které bojují s homopolymerními trakty. Mikrosatelity jsou proto normálně analyzovány konvenční PCR amplifikací a určováním velikosti amplikonu, někdy následuje Sangerovo sekvenování DNA .

Ve forenzní oblasti se analýza provádí extrakcí jaderné DNA z buněk požadovaného vzorku a poté amplifikací specifických polymorfních oblastí extrahované DNA pomocí polymerázové řetězové reakce . Jakmile jsou tyto sekvence amplifikovány, jsou rozděleny buď gelovou elektroforézou nebo kapilární elektroforézou , což analytikovi umožní určit, kolik opakování dotyčné sekvence mikrosatelitů existuje. Pokud byla DNA vyřešena gelovou elektroforézou, DNA může být vizualizována buď barvením stříbrem (nízká citlivost, bezpečná, levná), nebo interkalačním barvivem, jako je ethidiumbromid (poměrně citlivá, mírná zdravotní rizika, levná), nebo jako nejmodernější použití forenzních laboratoří, fluorescenční barviva (vysoce citlivá, bezpečná, drahá). Přístroje postavené k rozlišení mikrosatelitních fragmentů kapilární elektroforézou také používají fluorescenční barviva. Forenzní profily jsou uloženy ve velkých databankách. Britský databázi pro mikrosatelitní identifikaci loci byl původně založený na britské SGM + systému za použití 10 loci a sex značku . Američané tento počet zvýšili na 13 lokusů. Australská databáze se nazývá NCIDD a od roku 2013 používá pro profilování DNA 18 základních markerů.

Zesílení

Mikrosatelity lze amplifikovat pro identifikaci procesem polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití jedinečných sekvencí lemujících oblastí jako primerů . DNA se opakovaně denaturuje při vysoké teplotě, aby se oddělil dvouvláknový řetěz, pak se ochladí, aby se umožnilo hybridizaci primerů a prodloužení nukleotidových sekvencí přes mikrosatelit. Tento proces vede k produkci dostatečného množství DNA, které je viditelné na agarózových nebo polyakrylamidových gelech; k amplifikaci je zapotřebí pouze malé množství DNA, protože tímto způsobem termocyklování vytváří exponenciální nárůst replikovaného segmentu. S množstvím technologie PCR jsou primery obklopující mikrosatelitní lokusy jednoduché a rychle použitelné, ale vývoj správně fungujících primerů je často únavný a nákladný proces.

Řada vzorků DNA ze vzorků Littorina plena byla amplifikována pomocí polymerázové řetězové reakce s primery zaměřenými na lokus opakování variabilní jednoduché sekvence (SSR, alias mikrosatelit). Vzorky byly zpracovány na 5% polyakrylamidovém gelu a vizualizovány pomocí barvení stříbrem.

Návrh mikrosatelitních primerů

Při hledání mikrosatelitních markerů v konkrétních oblastech genomu, například v konkrétním intronu , lze primery navrhnout ručně. To zahrnuje hledání genomové DNA sekvence pro mikrosatelitní repetice, což lze provést okem nebo pomocí automatizovaných nástrojů, jako je maskovač opakování . Jakmile jsou určeny potenciálně užitečné mikrosatelity, mohou být sousední sekvence použity k návrhu oligonukleotidových primerů, které budou amplifikovat specifické mikrosatelitní opakování v reakci PCR.

Náhodné mikrosatelitní primery lze vyvinout klonováním náhodných segmentů DNA z ohniskových druhů. Tyto náhodné segmenty jsou vloženy do plazmidového nebo bakteriofágového vektoru , který je následně implantován do bakterií Escherichia coli . Kolonie se pak vyvíjejí a skrínují se fluorescenčně značenými oligonukleotidovými sekvencemi, které budou hybridizovat s mikrosatelitní repeticí, pokud jsou přítomny v segmentu DNA. Pokud lze z tohoto postupu získat pozitivní klony, DNA se sekvenuje a PCR primery se vyberou ze sekvencí lemujících takové oblasti pro stanovení specifického lokusu . Tento proces zahrnuje významné pokusy a omyly ze strany výzkumných pracovníků, protože musí být předvídány opakovací sekvence mikrosatelitů a primery, které jsou náhodně izolované, nemusí vykazovat významný polymorfismus. Mikrosatelitní lokusy jsou široce distribuovány po celém genomu a lze je izolovat ze semidegradované DNA starších vzorků, protože vše, co je potřeba, je vhodný substrát pro amplifikaci pomocí PCR.

Novější techniky zahrnují použití oligonukleotidových sekvencí sestávajících z opakování komplementárních k opakováním v mikrosatelitu k „obohacení“ extrahované DNA ( obohacování mikrosatelitem ). Oligonukleotidová sonda hybridizuje s opakováním v mikrosatelitu a komplex sonda/mikrosatelit se pak vytáhne z roztoku. Obohacená DNA se poté klonuje jako normální, ale podíl úspěchů bude nyní mnohem vyšší, což drasticky zkrátí čas potřebný k vývoji oblastí pro použití. Použité sondy však mohou být samy o sobě procesem pokusu a omylu.

ISSR-PCR

ISSR (pro inter-jednoduché sekvenční opakování ) je obecný termín pro oblast genomu mezi mikrosatelitními lokusy. Komplementární sekvence dvou sousedních mikrosatelitů se používají jako primery PCR; variabilní oblast mezi nimi se zesiluje. Omezená délka amplifikačních cyklů během PCR zabraňuje nadměrné replikaci příliš dlouhých souvislých sekvencí DNA, takže výsledkem bude kombinace různých amplifikovaných řetězců DNA, které jsou obecně krátké, ale v délce se velmi liší.

Sekvence amplifikované pomocí ISSR-PCR mohou být použity pro otisky prstů DNA. Protože ISSR může být konzervovanou nebo nekonzervovanou oblastí, není tato technika užitečná pro rozlišování jednotlivců, ale spíše pro fylogeografické analýzy nebo možná pro vymezení druhů ; diverzita sekvence je nižší než v SSR-PCR, ale stále vyšší než ve skutečných genových sekvencích. Mikrosatelitní sekvenování a ISSR sekvenování si navíc vzájemně pomáhají, protože jeden produkuje primery pro druhý.

Omezení

Opakující se DNA nelze snadno analyzovat metodami sekvenování DNA příští generace , které bojují s homopolymerními trakty. Mikrosatelity jsou proto normálně analyzovány konvenční PCR amplifikací a určováním velikosti amplikonu. Použití PCR znamená, že mikrosatelitní analýza délky je náchylná k omezením PCR, jako jakýkoli jiný lokus DNA amplifikovaný pomocí PCR. Zvláštní obavou je výskyt „ nulových alel “:

  • Občas může ve vzorku jedinců, jako je případ případu testování otcovství, mutace DNA obklopující mikrosatelit zabránit PCR primeru ve vazbě a produkci amplikonu (vytvoření „nulové alely“ v gelovém testu), tedy pouze jedné alely je amplifikován (z nemutovaného sesterského chromozomu) a jedinec se pak může falešně jevit jako homozygotní. To může způsobit zmatek v případu otcovství. Potom může být nutné zesílit mikrosatelit pomocí jiné sady primerů. Nulové alely jsou způsobeny zejména mutacemi ve 3 'sekci, kde začíná extenze.
  • Při analýze druhů nebo populace, například při ochraně přírody, mohou PCR primery, které zesilují mikrosatelity u jednoho jedince nebo druhu, fungovat u jiných druhů. Riziko aplikace primerů PCR napříč různými druhy však spočívá v tom, že nulové alely se stanou pravděpodobnými, kdykoli je divergence sekvence příliš velká na to, aby se primery mohly vázat. Tento druh se pak může uměle jevit, že má sníženou rozmanitost. Nulové alely v tomto případě mohou být někdy indikovány nadměrnou frekvencí homozygotů způsobujících odchylky od Hardy-Weinbergových rovnovážných očekávání.

Viz také

Reference

Další čtení

externí odkazy