Mikroskop - Microscope
.JPG) Mikroskop
| |
| Využití | Malé pozorování vzorku |
|---|---|
| Pozoruhodné experimenty | Objev buněk |
| Související zboží | Optický mikroskop Elektronový mikroskop |
Mikroskopu (ze staré řečtiny : μικρός Mikros ‚malé‘ a σκοπεῖν skopeîn ‚vypadat (at), zkoumat, zkontrolujte‘) je laboratorní přístroj používán zkoumat objekty, které jsou příliš malé být viděn pouhým okem . Mikroskopie je věda o zkoumání malých předmětů a struktur pomocí mikroskopu. Mikroskopický znamená být okem neviditelný, pokud mu nepomáhá mikroskop.
Existuje mnoho typů mikroskopů a mohou být seskupeny různými způsoby. Jedním ze způsobů je popsat metodu, kterou nástroj používá k interakci se vzorkem a vytváření obrazů, a to buď zasláním paprsku světla nebo elektronů vzorkem v jeho optické dráze , detekováním fotonových emisí ze vzorku nebo skenováním napříč a krátkou vzdálenost od povrchu vzorku pomocí sondy. Nejběžnějším mikroskopem (a prvním, který byl vynalezen) je optický mikroskop , který používá čočky k lámání viditelného světla, které prošlo tenkým řezem vzorku a vytváří pozorovatelný obraz. Dalšími hlavními typy mikroskopů jsou fluorescenční mikroskop , elektronový mikroskop ( přenosový elektronový mikroskop i rastrovací elektronový mikroskop ) a různé typy mikroskopů rastrovací sondy .
Dějiny
Přestože objekty připomínající čočky pocházejí z doby před 4 000 lety a existují řecké záznamy o optických vlastnostech sfér naplněných vodou (5. století př. N. L.), Po nichž následuje mnoho století psaní o optice, nejstarší známé použití jednoduchých mikroskopů ( lupy ) pochází z r. rozšířené používání čoček v brýlích ve 13. století. Nejstarší známé příklady složených mikroskopů, které kombinují objektiv v blízkosti vzorku s okulárem pro zobrazení skutečného obrazu , se objevily v Evropě kolem roku 1620. Vynálezce je neznámý, i když v průběhu let byla vznesena řada tvrzení. Několik se točí kolem středisek výroby brýlí v Nizozemsku , včetně tvrzení, že to bylo vynalezeno v roce 1590 Zachariasem Janssenem (tvrzením jeho syna) nebo Zachariášovým otcem Hansem Martensem, nebo oba tvrdí, že to byl vynalezen jejich sousedem a konkurenční podívanou výrobce, Hans Lippershey (který požádal o první patent dalekohledu v roce 1608) a tvrdí, že byl vynalezen krajanem Cornelisem Drebbelem , o kterém se říkalo , že má verzi v Londýně v roce 1619. Zdá se, že Galileo Galilei (také někdy uváděn jako vynálezce složeného mikroskopu) aby po roce 1610 zjistil, že by mohl zblízka zaostřit svůj dalekohled na prohlížení malých předmětů, a poté, co viděl složený mikroskop postavený Drebbelem vystavený v Římě v roce 1624, postavil vlastní vylepšenou verzi. Giovanni Faber vytvořil název mikroskop pro složený mikroskop Galileo předložený Accademia dei Lincei v roce 1625 (Galileo jej nazval occhiolino „malé oko“).
Vzestup moderních světelných mikroskopů
.jpg)
První podrobný popis mikroskopické anatomie organické tkáně založený na použití mikroskopu se objevil až v roce 1644, a to v L'occhio della mosca Giambattisty Odierny nebo The Fly's Eye .
Mikroskop byl stále do značné míry novinkou až do šedesátých a sedmdesátých let 16. století, kdy je přírodovědci v Itálii, Nizozemsku a Anglii začali používat ke studiu biologie. Italský vědec Marcello Malpighi , kterého někteří historici biologie nazývají otcem histologie , zahájil analýzu biologických struktur pomocí plic. Publikace v roce 1665 z Robert Hooke ‚s Micrographia měla obrovský dopad, a to především kvůli jeho působivé ilustrace. Významný příspěvek přinesla Antonie van Leeuwenhoek, která dosáhla až 300násobného zvětšení pomocí jednoduchého mikroskopu s jedním objektivem. Mezi otvory ve dvou kovových deskách nýtované dohromady vložil velmi malou skleněnou kuličkovou čočku a jehlu připevněnou nastavitelnými šrouby připevněnou k upevnění vzorku. Poté Van Leeuwenhoek znovu objevil červené krvinky (po Janu Swammerdamovi ) a spermie a pomohl popularizovat používání mikroskopů k prohlížení biologické ultrastruktury. Dne 9. října 1676 oznámil van Leeuwenhoek objev mikroorganismů.
Výkon světelného mikroskopu závisí na kvalitě a správném použití systému čoček kondenzátoru k zaostření světla na vzorek a objektivu k zachycení světla ze vzorku a vytvoření obrazu. Rané nástroje byly omezeny, dokud nebyl tento princip plně oceněn a vyvinut od konce 19. do velmi počátku 20. století, a dokud nebyly jako světelné zdroje k dispozici elektrické lampy. V roce 1893 vyvinul Köhler v srpnu klíčový princip osvětlení vzorku, Köhlerovo osvětlení , které je zásadní pro dosažení teoretických limitů rozlišení světelného mikroskopu. Tato metoda osvětlení vzorku produkuje rovnoměrné osvětlení a překonává omezený kontrast a rozlišení způsobené časnými technikami osvětlení vzorku. Další vývoj vzorku osvětlení pocházelo z objevu fázového kontrastu od Frits Zernike v roce 1953, a diferenciální interferenční kontrast osvětlení od Georges Nomarski v roce 1955; oba umožňují zobrazování nezbarvených, průhledných vzorků.
Elektronové mikroskopy
Na počátku 20. století byla vyvinuta významná alternativa ke světelnému mikroskopu, nástroj, který ke generování obrazu používá spíše paprsek elektronů než světlo . Německý fyzik Ernst Ruska ve spolupráci s elektrotechnikem Maxem Knollem vyvinul v roce 1931 první prototyp elektronového mikroskopu, transmisní elektronový mikroskop (TEM). Transmisní elektronový mikroskop pracuje na podobných principech jako optický mikroskop, ale používá elektrony místo světla a elektromagnety místo skleněných čoček. Použití elektronů místo světla umožňuje mnohem vyšší rozlišení.
Vývoj transmisního elektronového mikroskopu byl rychle následoval v roce 1935 vývoj rastrovacího elektronového mikroskopu pomocí Max Knoll . Ačkoli TEM byly používány pro výzkum před druhou světovou válkou a poté se staly populární, SEM nebyl komerčně dostupný až do roku 1965.
Transmisní elektronové mikroskopy se staly populární po druhé světové válce . Ernst Ruska, pracující ve společnosti Siemens , vyvinul první komerční transmisní elektronový mikroskop a v 50. letech 20. století se začaly pořádat velké vědecké konference o elektronové mikroskopii. V roce 1965 byl profesorem Sirem Charlesem Oatleyem a jeho postgraduálním studentem Garym Stewartem vyvinut první komerční rastrovací elektronový mikroskop a prodáván společností Cambridge Instrument Company jako „Stereoscan“.
Jedním z nejnovějších objevů provedených pomocí elektronového mikroskopu je schopnost identifikovat virus. Vzhledem k tomu, že tento mikroskop vytváří viditelný a jasný obraz malých organel, není v elektronovém mikroskopu potřeba činidel, která by viděla virus nebo škodlivé buňky, což má za následek efektivnější způsob detekce patogenů.
Mikroskopy skenovací sondy
Od roku 1981 do roku 1983 Gerd Binnig a Heinrich Rohrer pracoval v IBM v Curychu , Švýcarsku studovat kvantové tunelování jev. Vytvořili praktický nástroj, mikroskop skenovací sondy z teorie kvantového tunelování, který snímal velmi malé síly vyměněné mezi sondou a povrchem vzorku. Sonda se přibližuje k povrchu tak blízko, že elektrony mohou nepřetržitě proudit mezi sondou a vzorkem a vytvářet proud z povrchu do sondy. Mikroskop nebyl zpočátku dobře přijat kvůli složité povaze podkladových teoretických vysvětlení. V roce 1984 Jerry Tersoff a DR Hamann, zatímco v Bell Laboratories AT & T v Murray Hill, New Jersey začal publikovat články, které spojovaly teorii s experimentálními výsledky získanými nástrojem. To bylo v roce 1985 pozorně sledováno fungujícími komerčními nástroji a v roce 1986 Gerdem Binnigem, Quateem a Gerberovým vynálezem mikroskopu atomové síly , poté Binnigovou a Rohrerovou Nobelovou cenou za fyziku za SPM.
Vzhledem k tomu, že se schopnost obrábět ultrajemné sondy a hroty rozšířila, byly i nadále vyvíjeny nové typy mikroskopu pro skenovací sondy.
Fluorescenční mikroskopy
Nejnovější vývoj ve světelném mikroskopu se z velké části soustředí na vzestup fluorescenční mikroskopie v biologii . V posledních desetiletích 20. století, a to zejména v období po genomové době, mnoho technik pro fluorescenční barvení z buněčných byly vyvinuty struktury. Hlavní skupiny technik zahrnují cílené chemické barvení konkrétních buněčných struktur, například chemické sloučeniny DAPI pro značení DNA , použití protilátek konjugovaných s fluorescenčními reportéry, viz imunofluorescence a fluorescenční proteiny, jako je zelený fluorescenční protein . Tyto techniky používají tyto různé fluorofory pro analýzu buněčné struktury na molekulární úrovni v živých i fixních vzorcích.
Vzestup fluorescenční mikroskopie vedl k vývoji hlavního moderního designu mikroskopu, konfokálního mikroskopu . Princip byl patentován v roce 1957 Marvinem Minskym , ačkoli laserová technologie omezila praktické použití této techniky. To nebylo až do roku 1978, kdy Thomas a Christoph Cremer vyvinuli první praktický konfokální laserový skenovací mikroskop a tato technika si rychle získala popularitu v 80. letech minulého století.
Mikroskopy se super rozlišením
Hodně současný výzkum (na počátku 21. století) v technikách optického mikroskopu je zaměřen na vývoj superrezoluční analýzy fluorescenčně značených vzorků. Strukturované osvětlení může zlepšit rozlišení přibližně dvakrát až čtyřikrát a k řešení elektronových mikroskopů se blíží techniky jako mikroskopie se stimulovanou emisní deplecí (STED) . K tomu dochází, protože k difrakčnímu limitu dochází ze světla nebo excitace, což způsobuje, že rozlišení musí být zdvojnásobeno, aby se stalo velmi nasyceným. Stefan Hell získal Nobelovu cenu za chemii za vývoj techniky STED za rok 2014 spolu s Ericem Betzigem a Williamem Moernerem, kteří přizpůsobili fluorescenční mikroskopii pro vizualizaci jedné molekuly.
Rentgenové mikroskopy
Rentgenové mikroskopy jsou nástroje, které k zobrazení objektů používají elektromagnetické záření obvykle v měkkém rentgenovém pásmu. Technologický pokrok v optice rentgenových čoček na počátku 70. let minulého století učinil z tohoto přístroje životaschopnou volbu v oblasti zobrazování. Často se používají v tomografii (viz mikropočítačová tomografie ) k vytváření trojrozměrných obrazů předmětů, včetně biologických materiálů, které nebyly chemicky fixovány. V současné době probíhá výzkum s cílem zlepšit optiku pro tvrdé rentgenové paprsky, které mají větší penetrační sílu.
Typy
Mikroskopy lze rozdělit do několika různých tříd. Jedno seskupení je založeno na tom, co interaguje se vzorkem za účelem generování obrazu, tj. Světlo nebo fotony (optické mikroskopy), elektrony (elektronové mikroskopy) nebo sonda (mikroskopy skenovací sondy). Alternativně lze mikroskopy klasifikovat podle toho, zda analyzují vzorek pomocí skenovacího bodu (konfokální optické mikroskopy, rastrovací elektronové mikroskopy a mikroskopy rastrovací sondy) nebo analyzují vzorek najednou (širokoúhlé optické mikroskopy a transmisní elektronové mikroskopy).
Širokoúhlé optické mikroskopy a transmisní elektronové mikroskopy využívají teorii čoček ( optika pro světelné mikroskopy a elektromagnetické čočky pro elektronové mikroskopy) za účelem zvětšení obrazu generovaného průchodem vlny procházející vzorkem nebo odražené vzorkem. Používané vlny jsou elektromagnetické (v optických mikroskopech ) nebo elektronové paprsky (v elektronových mikroskopech ). Rozlišení v těchto mikroskopech je omezeno vlnovou délkou záření použitého k zobrazení vzorku, kde kratší vlnové délky umožňují vyšší rozlišení.
Skenovací optické a elektronové mikroskopy, jako je konfokální mikroskop a rastrovací elektronový mikroskop, používají čočky k zaostření světelného bodu nebo elektronů na vzorek a poté analyzují signály generované paprskem interagujícím se vzorkem. Bod se potom naskenuje přes vzorek, aby se analyzovala obdélníková oblast. Zvětšení obrazu je dosaženo zobrazením dat ze skenování fyzicky malé oblasti vzorku na relativně velké obrazovce. Tyto mikroskopy mají stejný limit rozlišení jako širokoúhlé optické, sondové a elektronové mikroskopy.
Mikroskopy skenovací sondy také analyzují jeden bod ve vzorku a poté skenují sondu přes obdélníkovou oblast vzorku, aby se vytvořil obraz. Protože tyto mikroskopy nepoužívají k zobrazování elektromagnetické nebo elektronové záření, nepodléhají stejnému limitu rozlišení jako výše popsané optické a elektronové mikroskopy.
Optický
Nejběžnějším typem mikroskopu (a prvním vynalezeným) je optický mikroskop . Jedná se o optický přístroj obsahující jednu nebo více čoček vytvářejících zvětšený obraz vzorku umístěného v ohniskové rovině. Optické mikroskopy mají refrakční sklo (příležitostně plastové nebo křemenné ), aby zaostřily světlo na oko nebo na jiný světelný detektor. Zrcadlové optické mikroskopy fungují stejným způsobem. Typické zvětšení světelného mikroskopu za předpokladu světla ve viditelném rozsahu je až 1250x s teoretickým limitem rozlišení kolem 0,250 mikrometrů nebo 250 nanometrů . To omezuje praktické zvětšení na ~ 1500x. Specializované techniky (např. Skenovací konfokální mikroskopie , Vertico SMI ) mohou toto zvětšení překročit, ale rozlišení je omezeno difrakcí . Použití kratších vlnových délek světla, jako je ultrafialové, je jedním ze způsobů, jak zlepšit prostorové rozlišení optického mikroskopu, stejně jako zařízení, jako je skenovací optický mikroskop blízkého pole .
Sarfus je nedávná optická technika, která zvyšuje citlivost standardního optického mikroskopu do bodu, kdy je možné přímo vizualizovat nanometrické filmy (až do 0,3 nanometru) a izolované nanoobjekty (až do průměru 2 nm). Tato technika je založena na použití nereflexních substrátů pro křížovou polarizovanou mikroskopii odraženého světla.
Ultrafialové světlo umožňuje rozlišení mikroskopických rysů i zobrazování vzorků, které jsou pro oko průhledné. Blízké infračervené světlo lze použít k vizualizaci obvodů vložených do zařízení z lepeného křemíku, protože křemík je v této oblasti vlnových délek transparentní.
Ve fluorescenční mikroskopii lze použít mnoho vlnových délek světla od ultrafialového po viditelné, aby vzorky fluoreskovaly , což umožňuje prohlížení okem nebo specificky citlivými kamerami.
Fázová kontrastní mikroskopie je technika optického mikroskopického osvětlení, při které se malé fázové posuny světla procházejícího průhledným vzorkem převádějí na amplitudu nebo změny kontrastu v obraze. Použití fázového kontrastu nevyžaduje barvení pro zobrazení sklíčka. Tato mikroskopická technika umožnila studovat buněčný cyklus v živých buňkách.
Tradiční optický mikroskop se v poslední době vyvinul v digitální mikroskop . Kromě nebo místo přímého prohlížení objektu okulárem se k získání obrazu používá typ senzoru podobný těm, které se používají v digitálním fotoaparátu , který je pak zobrazen na monitoru počítače. Tyto senzory mohou v závislosti na aplikaci používat CMOS nebo technologii CCD ( Charge-Couled Device ).
Digitální mikroskopie s velmi nízkou úrovní osvětlení, aby se zabránilo poškození citlivých biologických vzorků, je k dispozici pomocí citlivých digitálních fotoaparátů počítajících fotony . Bylo prokázáno, že světelný zdroj poskytující páry spletených fotonů může minimalizovat riziko poškození vzorků nejcitlivějších na světlo. Při této aplikaci zobrazení duchů na fotonově řídkou mikroskopii je vzorek osvětlen infračervenými fotony, z nichž každý je prostorově korelován se zapleteným partnerem ve viditelném pásmu pro efektivní zobrazování pomocí fotonové kamery.
Elektron
Dva hlavní typy elektronových mikroskopů jsou transmisní elektronové mikroskopy (TEM) a rastrovací elektronové mikroskopy (SEM). Oba mají řadu elektromagnetických a elektrostatických čoček pro zaostření paprsku elektronů s vysokou energií na vzorek. V TEM procházejí elektrony vzorkem, analogicky k základní optické mikroskopii . To vyžaduje pečlivou přípravu vzorku, protože elektrony jsou silně rozptýleny většinou materiálů. Aby mohly elektrony projít, musí být také velmi tenké (pod 100 nm). Průřezy buněk obarvených osmiem a těžkými kovy odhalují čiré membrány organel a proteiny, jako jsou ribozomy. S rozlišením 0,1 nm lze získat detailní pohled na viry (20 - 300 nm) a vlákno DNA (2 nm na šířku). Naproti tomu SEM má rastrové cívky pro skenování povrchu objemných objektů jemným elektronovým paprskem. Vzorek proto nemusí být nutně rozřezán, ale pro nevodivé vzorky může být zapotřebí potažení nanometrickou kovovou nebo uhlíkovou vrstvou. SEM umožňuje rychlé povrchové zobrazování vzorků, případně v tenké vodní páře, aby se zabránilo vysychání.
Snímací sonda
Různé typy mikroskopů skenovací sondy vycházejí z mnoha různých typů interakcí, ke kterým dochází při skenování malé sondy a interakci se vzorkem. Tyto interakce nebo režimy mohou být zaznamenávány nebo mapovány jako funkce umístění na povrchu za vzniku mapy charakteristik. Tři nejběžnější typy mikroskopů pro skenovací sondy jsou mikroskopy atomové síly (AFM), skenovací optické mikroskopy pro blízké pole (MSOM nebo SNOM, skenovací optická mikroskopie pro blízké pole) a skenovací tunelové mikroskopy (STM). Mikroskop atomové síly má jemnou sondu, obvykle z křemíku nebo nitridu křemíku, připevněnou ke konzole; sonda se skenuje po povrchu vzorku a měří a mapují síly, které způsobují interakci mezi sondou a povrchem vzorku. Skenovací optický mikroskop blízkého pole je podobný AFM, ale jeho sonda se skládá ze světelného zdroje v optickém vlákně pokrytého špičkou, která má obvykle otvor pro průchod světla. Mikroskop může zachytit buď procházející nebo odražené světlo a měřit velmi lokalizované optické vlastnosti povrchu, běžně biologického vzorku. Skenovací tunelové mikroskopy mají kovovou špičku s jediným apikálním atomem; hrot je připevněn k trubici, kterou protéká proud. Špička je skenována po povrchu vodivého vzorku, dokud neteče tunelový proud; proud je udržován konstantní počítačovým pohybem hrotu a obraz je tvořen zaznamenanými pohyby hrotu.
Jiné typy
Skenovací akustické mikroskopy používají zvukové vlny k měření variací akustické impedance. Podobně jako Sonar v zásadě se používají pro takové úlohy, jako je detekce vad v podpovrchových plochách materiálů, včetně těch, které se nacházejí v integrovaných obvodech. 4. února 2013 sestrojili australští inženýři „kvantový mikroskop“, který poskytuje bezkonkurenční přesnost.
