Vedení nervu - Nerve guidance conduit

Nerv vedení potrubí (označované také jako umělé nervového vedení nebo umělé nervového transplantátu , na rozdíl od autograft ) je umělá prostředkem vedení axonů opětovný růst usnadnit regeneraci nervů a je jedním z několika klinických léčby zranění nervu . Pokud přímého šití dvou pahýlů přerušení nervu nelze provést bez napětí, standardní klinickou léčbou poranění periferních nervů je autologní roubování nervu . Vzhledem k omezené dostupnosti dárcovské tkáně a funkční regeneraci při autologním nervovém štěpování se výzkum neurálního tkáňového inženýrství zaměřil na vývoj vedení bioartificiálních nervů jako alternativní léčby, zejména u velkých defektů. Podobné techniky jsou také zkoumány pro opravu nervů v míše, ale nervová regenerace v centrálním nervovém systému představuje větší výzvu, protože její axony se v jejich původním prostředí znatelně neregenerují.

Vytváření umělých trubek je také známé jako entubulace, protože nervové konce a zasahující mezera jsou uzavřeny v trubici složené z biologických nebo syntetických materiálů. Ať už je trubka ve formě biologické trubice, syntetické trubice nebo trubice vytvořené tkáňovým inženýrstvím, měla by usnadňovat neurotropní a neurotrofickou komunikaci mezi proximálním a distálním koncem nervové mezery, blokovat vnější inhibiční faktory a poskytovat fyzické vedení pro axonální opětovný růst. Nejzákladnějším cílem vedení pro vedení nervů je kombinovat fyzikální, chemické a biologické podněty za podmínek, které podporují tvorbu tkáně.

Materiály, které byly použity k výrobě biologických zkumavek, zahrnují krevní cévy a kosterní svaly, zatímco neabsorbovatelné a biologicky vstřebatelné syntetické zkumavky byly vyrobeny ze silikonu a polyglykolidu . Vedení nervů vedená tkáňovým inženýrstvím je kombinací mnoha prvků: struktura lešení, materiál lešení, buněčné terapie, neurotrofické faktory a biomimetické materiály. Výběr fyzických, chemických a biologických podnětů k použití je založen na vlastnostech nervového prostředí, které je rozhodující při vytváření nejžádanějšího prostředí pro regeneraci axonů. Mezi faktory, které řídí výběr materiálu, patří biokompatibilita , biodegradabilita , mechanická integrita, ovladatelnost během růstu nervů, implantace a sterilizace.

Topografie lešení

V tkáňovém inženýrství jsou tři hlavní úrovně struktury lešení považovány za:

nástavba, celkový tvar lešení;
mikrostruktura, struktura buněčné úrovně povrchu; a
nanostruktura, subcelulární úroveň struktury povrchu.

Nástavba

Superstruktura potrubí nebo lešení je důležitá pro simulaci podmínek in vivo pro tvorbu nervové tkáně. Extracelulární matrix, která je zodpovědná hlavně za usměrňování růstu a tvorby tkáně, má komplexní nadstavbu vytvořenou mnoha propletenými vláknitými molekulami. Způsoby vytváření umělé nástavby zahrnují použití tepelně citlivých hydrogelů, podélně orientovaných kanálů, podélně orientovaných vláken, natažených axonů a nanovlákenných lešení.

Tepelně citlivé hydrogely

Při traumatickém poranění mozku (TBI) je zahájena řada škodlivých událostí, které vedou k buněčné smrti a celkové dysfunkci, které způsobují vznik dutiny léze nepravidelného tvaru. Výsledná dutina způsobuje lešení tkáňového inženýrství mnoho problémů, protože je nutná invazivní implantace a lešení často nevyhovuje tvaru dutiny. Aby se tyto obtíže obešly, byly tepelně citlivé hydrogely navrženy tak, aby procházely přechody gelace v roztoku (sol-gel), které jsou způsobeny rozdíly v pokojové a fyziologické teplotě, aby se usnadnila implantace prostřednictvím gelace in situ a přizpůsobení tvaru dutiny způsobil, což jim umožnilo minimálně invazivní injekci.

Methylcelulóza (MC) je materiál s dobře definovanými přechody sol-gel v optimálním rozmezí teplot. Ke gelovatění MC dochází v důsledku zvýšení intra- a intermolekulárních hydrofobních interakcí při zvyšování teploty. Přechod sol-gel se řídí nižší kritickou teplotou roztoku (LCST), což je teplota, při které se modul pružnosti rovná modulu viskóznosti. LCST nesmí překročit fyziologickou teplotu (37 ° C), pokud má lešení po implantaci zgelovatět, aby se vytvořil minimálně invazivní porod. Po implantaci do dutiny léze TBI nebo vedení pro vedení periferních nervů vyvolává MC minimální zánětlivou odpověď. Pro minimálně invazivní podávání je také velmi důležité, aby roztok MC měl viskozitu při teplotách nižších než LCST, což umožňuje jeho injekci přes jehlu malého kalibru pro implantaci v aplikacích in vivo . MC byl úspěšně použit jako doručovací prostředek pro intraoptické a orální farmaceutické terapie. Některé nevýhody MC zahrnují jeho omezenou náchylnost k adsorpci proteinů a neuronální buněčnou adhezi, což z něj činí nebioaktivní hydrogel. Kvůli těmto nevýhodám vyžaduje použití MC při regeneraci nervové tkáně připojení biologicky aktivní skupiny na polymerní páteř, aby se zlepšila adheze buněk.

Dalším tepelně citlivým gelem je gel, který je vytvořen kombinací chitosanu s glycerofosfátovou (GP) solí. Toto řešení zažije gelování při teplotách nad 37 ° C. Gelovatění chitosanu/GP je poměrně pomalé, zpočátku trvá půl hodiny a 9 hodin se úplně stabilizuje. Síla gelu se pohybuje od 67 do 1572 Pa v závislosti na koncentraci chitosanu; spodní konec tohoto rozsahu se blíží tuhosti mozkové tkáně. Chitosan/GP prokázal úspěch in vitro , ale přidání polylysinu je nutné pro zlepšení přichycení nervových buněk. Polylysin byl kovalentně vázán na chitosan, aby se zabránilo jeho difúzi. Polylysin byl vybrán kvůli jeho pozitivní povaze a vysoké hydrofilitě, která podporuje růst neuritů . Přežití neuronů se zdvojnásobilo, ačkoli růst neuritů se s přidaným polylysinem nezměnil.

Podélně orientované kanály

Podélně orientované kanály jsou makroskopické struktury, které lze přidat do potrubí, aby poskytly regenerujícím axonům přesně definované vedení pro růst rovně podél lešení. V lešení s architekturou mikrotubulárních kanálů jsou regenerující se axony schopné procházet otevřenými podélnými kanály, jako by normálně procházely endoneuriálními trubicemi periferních nervů. Kanály navíc zvětšují povrchovou plochu dostupnou pro kontakt buňky. Kanály jsou obvykle vytvořeny vložením jehly, drátu nebo druhého polymerního roztoku do polymerového lešení; po stabilizaci tvaru hlavního polymeru se jehla, drát nebo druhý polymer odstraní, aby se vytvořily kanály. Obvykle je vytvořeno více kanálů; lešení však může sestávat pouze z jednoho velkého kanálu, což je jednoduše jedna dutá trubka.

Wang et al. pro vytvoření nervového vedení s vícekanálovou vnitřní matricí a vnější stěnou trubice z chitosanu. Ve své studii z roku 2006 Wang et al. závitové akupunkturní jehly dutou chitosanovou trubicí, kde jsou drženy na místě upevněním na obou koncích záplat vytvořených pomocí CAD. Potom se do zkumavky vstříkne roztok chitosanu a ztuhne, načež se jehly vyjmou a vytvoří se podélně orientované kanály. Poté bylo vytvořeno reprezentativní lešení pro charakterizaci s 21 kanály pomocí akupunkturních jehel o průměru 400 µm. Při zkoumání pod mikroskopem bylo zjištěno, že kanály jsou přibližně kruhové s mírnými nepravidelnostmi; všechny kanály byly zarovnány s vnitřním průměrem vnější stěny trubky. Mikro CT zobrazením bylo potvrzeno, že kanály prošly celou délkou lešení. Při absorpci vody se vnitřní a vnější průměr lešení zvětšily, ale průměry kanálů se výrazně nelišily, což je nezbytné pro udržení tvaru lešení, které vede rozšíření neuritů. Vnitřní struktura poskytuje zvýšení pevnosti v tlaku ve srovnání se samotnou dutou trubkou, která může zabránit kolapsu lešení na rostoucí neurity. Buňky Neuro-2a byly schopné růst na vnitřní matrici lešení a orientovaly se podél kanálů. Přestože byla tato metoda testována pouze na chitosanu, lze ji přizpůsobit jiným materiálům.

lyofilizace a ohřev drátu je další způsob vytváření podélně orientovaných kanálů, vyvinutý Huang et al. (2005). Roztok chitosanu a kyseliny octové byl zmrazen kolem drátů nikl-měď (Ni-Cu) v lapači kapalného dusíku ; následně se dráty zahřály a odstranily. Ni-Cu dráty byly vybrány, protože mají vysokou úroveň odporu. K sublimaci kyseliny octové byly použity lyofilizátory s řízenou teplotou. Neexistovaly žádné důkazy o slučování nebo rozdělování kanálů. Po lyofilizaci se rozměry lešení zmenšily, což způsobilo, že kanály byly o něco menší než použitý drát. Lešení byla neutralizována na fyziologickou hodnotu pH pomocí báze, což mělo dramatické účinky na porézní strukturu. Slabší báze udržovaly porézní strukturu jednotnou, ale silnější základna ji znemožňovala ovládat. Zde použitá technika může být mírně upravena tak, aby vyhovovala jiným polymerům a rozpouštědlům.

Dalším způsobem, jak vytvořit podélně orientované kanály, je vytvořit potrubí z jednoho polymeru s vloženými podélně orientovanými vlákny z jiného polymeru; potom selektivně rozpustí vlákna za vzniku podélně orientovaných kanálů. Polykaprolaktonová (PCL) vlákna byla vložena do (hydroxyethyl) methakrylátového (HEMA) lešení. PCL byl vybrán před poly (mléčnou kyselinou) (PLA) a poly (mléčnou-ko-glykolovou kyselinou) (PLGA), protože je nerozpustný v HEMA, ale rozpustný v acetonu . To je důležité, protože pro materiál hlavního potrubí byla použita HEMA a pro selektivní rozpouštění polymerních vláken byl použit aceton. Vytlačená vlákna PCL byla vložena do skleněné zkumavky a vstříknut roztok HEMA. Počet vytvořených kanálů byl konzistentní od šarže k šarži a rozdíly v průměru vlákna mohly být sníženy vytvořením kontrolovanějšího vytlačovacího systému vláken PCL. Vytvořené kanály byly potvrzeny jako kontinuální a homogenní zkoumáním změn pórovitosti. Tento proces je bezpečný, reprodukovatelný a má kontrolovatelné rozměry. V podobné studii provedené Yu a Shoichetem (2005) byla HEMA kopolymerována s AEMA za vzniku gelu P (HEMA-co-AMEA). Vlákna polykaprolaktonu (PCL) byla vložena do gelu a poté selektivně rozpuštěna acetonem se sonikací za vzniku kanálů. Bylo zjištěno, že HEMA ve směsi s 1% AEMA vytvořila nejsilnější gely. Ve srovnání s lešeními bez kanálů může přidání 82–132 kanálů zajistit přibližně 6–9násobné zvětšení povrchu, což může být výhodné pro studie regenerace, které závisí na kontaktem zprostředkovaných narážkách.

Itoh a kol. (2003) vyvinuli lešení sestávající z jediného velkého podélně orientovaného kanálu vytvořeného pomocí chitosanových šlach z krabů. Z krabů (Macrocheira kaempferi) byly odebrány šlachy a opakovaně promyty roztokem hydroxidu sodného k odstranění proteinů a k deacetylaci chitinu šlachy , který se následně stal známým jako chitosan šlachy. Tyč z nerezové oceli s průřezem trojúhelníkového tvaru (každá strana dlouhá 2,1 mm) byla vložena do duté chitosanové trubice s kruhovým průřezem (průměr: 2 mm; délka: 15 mm). Při porovnávání trubek kruhového a trojúhelníkového tvaru bylo zjištěno, že trojúhelníkové trubky zlepšily mechanickou pevnost, lépe držely svůj tvar a zvětšily dostupnou povrchovou plochu. I když je to efektivní metoda pro vytváření jednoho kanálu, neposkytuje tolik povrchu pro buněčný růst jako vícekanálové lešení.

Newman a kol. (2006) vložili vodivá i nevodivá vlákna do lešení kolagenu-TERP (kolagen zesíťovaný terpolymerem poly (N-isopropylakrylamidu) (PNiPAAm)). Vlákna byla vložena pevným zabalením na malé skleněné podložní sklíčko a vložením roztoku kolagenu-TERP mezi něj a další skleněné podložní sklíčko; mezerníky mezi skleněnými sklíčky nastavily tloušťku gelu na 800 µm. Vodivá vlákna byla uhlíková vlákna a kevlar a nevodivá vlákna byla nylon-6 a wolframový drát. Neurity se rozprostírají ve všech směrech v tlustých svazcích na uhlíkových vláknech; avšak s dalšími třemi vlákny se neurity rozšířily do jemných pavučinovitých konformací. Neurity nevykazovaly žádný směrový růst na uhlíkových a kevlarových vláknech, ale rostly podél vláken nylon-6 a do určité míry podél wolframového drátu. Wolframový drát a lešení vláken z nylonu-6 vedlo k růstu neuritů do gelu v blízkosti rozhraní vlákno-gel kromě růstu podél povrchu. Všechny vláknité gely kromě kevlaru vykazovaly významný nárůst prodloužení neuritů ve srovnání s gely bez vláken. V prodloužení neuritů mezi nevodivými a vodivými vlákny nebyl žádný rozdíl.

Ve své studii z roku 2005 Cai et al. do dutých poly (mléčných) kyselin (PLA) a silikonových zkumavek byla přidána polyvláknová poly (L-kyselina mléčná) (PLLA) . Charakteristiky vedení mikrovlákna byly nepřímo úměrné průměru vlákna s menšími průměry podporujícími lepší podélně orientovanou migraci buněk a regeneraci axonů. Mikrovlákna také podporovala myelinizaci během opravy periferních nervů.

Natažené axony

U zralých axonových traktů byl prokázán růst při mechanickém natažení ve střední části axonového válce. Takový mechanický úsek byl aplikován vlastním bioreaktorem protahování axonů, který se skládá ze čtyř hlavních komponent: expanzní komora navržená na míru, lineární pohybový stůl, krokový motor a ovladač. Kultura nervové tkáně je umístěna v expanzní komoře s portem pro výměnu plynu a odnímatelným napínacím rámem, který je schopen oddělit dvě skupiny somů (těla neuronových buněk) a tím natáhnout jejich axony. Kolagenový gel byl použit k podpoře růstu větších natažených axonových traktů, které byly viditelné pouhým okem. Existují dva důvody pro zvýšení růstu v důsledku kolagenového povlaku: 1) kultura se po vysušení kolagenu stala hydrofobní, což umožnilo růst hustší koncentrace neuronů, a 2) kolagenový povlak vytvořil nerušený povlak na dvou prodloužených substrátech . Vyšetření skenovacím elektronovým mikroskopem a TEM neukázalo žádné známky ztenčení axonu v důsledku natažení a cytoskelet se zdál být normální a neporušený. Roztažené axonové trakty byly kultivovány na biokompatibilní membráně, kterou bylo možné přímo zformovat do válcové struktury pro transplantaci, což eliminuje potřebu přenosu axonů na lešení po dokončení růstu. Roztažené axony byly schopné růst nevídanou rychlostí 1 cm/den po pouhých 8 dnech aklimatizace, což je mnohem větší než maximální rychlost růstu 1 mm/den, měřeno pro prodloužení růstového kužele. Rychlost 1 mm/den je také průměrnou dopravní rychlostí pro strukturální prvky, jako jsou neurofilamenty.

Nanovlákna lešení

Výzkum nanoscalových vláken se pokouší napodobit mimobuněčné prostředí in vivo za účelem podpory směrového růstu a regenerace. Tři odlišné metody pro vytváření nanovlákenných lešení jsou vlastní montáž, fázová separace a elektrostatické zvlákňování. Existuje však mnoho dalších metod pro vytváření nanovlákenných lešení.

Vlastní montáž nanovlákenných lešení je možná pouze tehdy, když jsou samotná vlákna konstruována pro vlastní montáž. Jedním z běžných způsobů, jak řídit vlastní sestavování vláken lešení, je použití amfifilních peptidů tak, aby ve vodě hydrofobní skupina poháněla samo-sestavování. Pečlivě vypočítané inženýrství amfifilních peptidů umožňuje přesnou kontrolu nad vlastní sestavenou matricí. Samosestavování je schopno vytvářet jak uspořádané, tak neuspořádané topografie. Phillips a kol. (2005) vyvinuli a testovali in vitro a in vivo samonastavenou kolagenovou - Schwannovu buněčnou matici, která umožňovala zarovnání prodloužení neuritu DRG in vitro . Kolagenové gely byly široce používány jako substráty pro trojrozměrné tkáňové kultury . Buňky jsou schopné vytvářet integrinem zprostředkované přílohy s kolagenem, který iniciuje sestavení cytoskeletu a pohyblivost buněk. Jak se buňky pohybují podél kolagenových vláken, vytvářejí síly, které stahují gel. Když jsou kolagenová vlákna uvázána na obou koncích, síly generované buňkami vytvoří jednoosý kmen, což způsobí zarovnání buněk a kolagenových vláken. Výhodou této matrice je její jednoduchost a rychlost přípravy. Rozpustný plazmatický fibronektin se může také sám sestavit do stabilních nerozpustných vláken, když je vystaven přímému mechanickému střihu ve viskózním roztoku. Phillips a kol. (2004) zkoumali novou metodu smykové agregace, která způsobuje zlepšenou agregaci. Mechanické stříhání bylo vytvořeno vytažením bolusu 0,2 ml na 3 cm pomocí kleští; agregáty fibronektinu do nerozpustných vláken na rychle se pohybujícím rozhraní v ultrafiltrační buňce. Navrhovaným mechanismem pro tuto agregaci vláken je prodloužení a prodloužení proteinu za mechanické střihové síly, což vede k laterálnímu balení a agregaci proteinů vláken. Phillips a kol. ukázal, že mechanický střih produkovaný roztažením vysoce viskózního fibronektinového gelu způsobuje podstatné změny ve jeho struktuře a že při aplikaci přes jednoosé prodloužení vytváří viskózní fibronektinový gel orientované agregáty vláknitých fibronektinů; dále mají vláknité agregáty sníženou rozpustnost a mohou podporovat různé typy buněk in vitro.

Fázová separace umožňuje vytvoření trojrozměrných submikrometrových vlákenných lešení bez použití specializovaného vybavení. Pět fází zahrnujících fázovou separaci je rozpuštění polymeru, fázová separace a gelování, extrakce rozpouštědlem z gelu, zmrazení a lyofilizace ve vodě. Konečným produktem je nepřetržitá optická síť. Fázovou separaci lze upravit tak, aby vyhovovala mnoha různým aplikacím, a strukturu pórů lze měnit pomocí různých rozpouštědel, která mohou změnit celý proces z kapaliny na kapalinu na tuhou kapalinu. Poréznost a průměr vlákna lze také upravit změnou počáteční koncentrace polymeru; vyšší počáteční koncentrace vede k menšímu počtu pórů a větším průměrům vláken. Tuto techniku lze použít k vytvoření sítí vláken o průměru dosahujícím průměrů kolagenových vláken typu I. Vytvořená vláknitá síť je náhodně orientovaná a doposud nebyla provedena snaha uspořádat vlákna. Fázová separace je široce používanou technikou pro snadné vytváření vysoce porézních nanovlákenných lešení.

Elektrospinning poskytuje robustní platformu pro vývoj syntetických nervových naváděcích vedení. Elektrospinning může sloužit k vytváření lešení v kontrolovaných rozměrech s různou chemií a topografií. Kromě toho mohou být různé materiály zapouzdřeny ve vláknech, včetně částic, růstových faktorů a dokonce buněk. Elektrospinning vytváří vlákna elektrickým nabitím kapičky polymerní taveniny nebo roztoku a jejím suspendováním z kapiláry. Poté se na jeden konec kapiláry aplikuje elektrické pole, dokud náboj nepřekročí povrchové napětí, čímž se vytvoří polymerový paprsek, který se prodlouží a ztenčí. Tento proud polymeru se vypouští jako Taylorův kužel a zanechává za sebou elektricky nabité polymery, které se shromažďují na uzemněném povrchu, když se rozpouštědlo odpařuje z trysek. Vlákna byla spřádána o průměrech od méně než 3 nm do více než 1 µm. Proces je ovlivněn parametry systému, jako je typ polymeru, molekulová hmotnost polymeru a vlastnosti roztoku, a parametry procesu, jako je průtok, napětí, průměr kapiláry, vzdálenost mezi kolektorem a kapilárou a pohyb kolektoru. Vytvořená vláknitá síť je neuspořádaná a obsahuje vysoký poměr povrchu k objemu v důsledku vysoké pórovitosti; velká plocha povrchu sítě je ideální pro růst a transport odpadů a živin v nervovém tkáňovém inženýrství. Dva rysy elektrospunových lešení, které jsou výhodné pro inženýrství neurální tkáně, jsou morfologie a architektura, která napodobuje ECM, a póry, které jsou správným rozsahem velikostí, které umožňují výměnu živin, ale brání růstu tkáně gliových jizev (kolem 10 µm). Bylo prokázáno, že náhodné elektrospunované lešení PLLA má zvýšenou adhezi buněk, což může být způsobeno zvýšenou drsností povrchu. Bylo také ukázáno, že chemicky modifikované elektrospunové vláknité rohože ovlivňují diferenciaci nervových kmenových buněk a zvyšují proliferaci buněk. V uplynulém desetiletí vědci také vyvinuli řadu metod pro výrobu zarovnaných lešení z nanovláken, které slouží k poskytnutí dalších topografických podnětů k buňkám. To je výhodné, protože trojrozměrná zarovnaná lešení ve velkém měřítku nelze snadno vytvářet pomocí tradičních výrobních technik. Ve studii provedené Yang et al. (2005) byly vytvořeny, charakterizovány a porovnány zarovnané a náhodné elektrospunové poly (L-mléčné kyseliny) (PLLA) mikrovláknové a nanovlákenné lešení. Průměry vláken byly přímo úměrné počáteční koncentraci polymeru použité pro elektrostatické zvlákňování; průměrný průměr zarovnaných vláken byl menší než průměr náhodných vláken za stejných podmínek zpracování. Ukázalo se, že nervové kmenové buňky se protáhly rovnoběžně s vyrovnanými elektrospunovými vlákny. Zarovnaná nanovlákna měla delší průměrnou délku neuritu ve srovnání se zarovnanými mikrovlákny, náhodnými mikrovlákny a náhodnými nanovlákny. Kromě toho se na zarovnaných nanovláknech diferencovalo více buněk než zarovnaných mikrovláken. Výsledky této studie tedy prokázaly, že zarovnaná nanovlákna mohou být pro podporu regenerace nervů výhodnější než nevyrovnaná vlákna nebo mikrovlákna.

Mikrostruktura a nanostruktura

Mikrostruktura a nanostruktura spolu s nadstavbou jsou tři hlavní úrovně struktury lešení, které si zaslouží pozornost při vytváření topografie lešení. Zatímco nadstavba odkazuje na celkový tvar lešení, mikrostruktura se týká struktury buněčné úrovně povrchu a nanostruktura odkazuje na subcelulární strukturu úrovně povrchu. Všechny tři úrovně struktury jsou schopné vyvolat buněčné reakce; existuje však značný zájem o reakci buněk na topografii v nanoměřítku motivovanou přítomností mnoha struktur v nanoměřítku v extracelulární matrici. Existuje rostoucí počet metod pro výrobu mikro- a nanostruktur (mnoho z nich pochází z polovodičového průmyslu), které umožňují vytváření různých topografií s kontrolovanou velikostí, tvarem a chemií.

Fyzické narážky

Fyzické narážky se vytvářejí vytvořením uspořádané povrchové struktury na úrovni mikrostruktury a/nebo nanostruktury. Bylo ukázáno, že fyzikální narážky na nanoúrovni modulují buněčnou adhezi, migraci, orientaci, kontaktní inhibici, genovou expresi a tvorbu cytoskeletu. To umožňuje směr buněčných procesů, jako je proliferace, diferenciace a šíření. Existuje mnoho způsobů výroby topografií v mikro a nanometrech, které lze rozdělit na ty, které vytvářejí uspořádané topografie, a ty, které vytvářejí neuspořádané topografie.

Objednané topografie jsou definovány jako vzory, které jsou organizované a geometricky přesné. Ačkoli existuje mnoho metod pro vytváření uspořádaných topografií, jsou obvykle časově náročné, vyžadují dovednosti a zkušenosti a používají drahé vybavení.

Fotolitografie zahrnuje vystavení světelného zdroje křemíkové destičce potažené fotoodporem; mezi světelný zdroj a oplatku je umístěna maska s požadovaným vzorem, čímž se selektivně umožní filtrování světla a vytvoření vzoru na fotorezistu . Další vývoj oplatky přináší obraz ve fotorezistu. Fotolitografie prováděná v blízkosti ultrafialového záření je často považována za standard pro výrobu topografií v mikro měřítku. Protože je však spodní limit velikosti funkcí vlnové délky, nelze tuto metodu použít k vytváření prvků v nanoměřítku. Ve své studii z roku 2005 Mahoney et al. vytvořená organizovaná pole polyimidových kanálů (11 µm na výšku a 20–60 µm na šířku) byla vytvořena na skleněném substrátu fotolitografií. Byl použit polyimid, protože dobře přilne ke sklu, je chemicky stabilní ve vodném roztoku a je biokompatibilní. Předpokládá se, že mikrokanály omezují rozsah úhlů, které by mohly akumulovat, shromažďovat a orientovat cytoskeletální prvky v kuželech růstu neuritů. Došlo k významnému snížení počtu neuritů vycházejících ze soma; došlo však k menšímu poklesu, protože se zvětšil rozsah úhlů, nad kterými se objevily neurity. Také neurity byly v průměru dvakrát delší, když byly neurony kultivovány na mikrokanálech oproti kontrolám na rovném povrchu; to může být způsobeno efektivnějším zarovnáním vláken.

V litografii elektronového paprsku (EBL) je rezistor citlivý na elektrony vystaven paprsku vysokoenergetických elektronů. Existuje výběr kladného nebo záporného typu odporu; nižšího rozlišení funkce však lze dosáhnout pomocí záporných odporů. Vzory jsou vytvářeny programováním paprsku elektronů pro přesnou dráhu, která má následovat po povrchu materiálu. Rozlišení je ovlivněno dalšími faktory, jako je rozptyl elektronů v rezistoru a zpětný rozptyl ze substrátu. EBL může vytvářet vlastnosti jednoho povrchu v řádu 3–5 nm. Pokud je požadováno více prvků na velké ploše, jako je tomu v tkáňovém inženýrství, rozlišení klesá a prvky lze vytvářet pouze při velikosti 30–40 nm a vývoj rezistů začíná při tvorbě vzoru více tížit. Aby se zabránilo rozpouštění odporu, lze k překonání mezimolekulárních sil použít ultrazvukové míchání. Kromě toho, isopropylalkohol (IPA), přispívá k rozvoji pole s vysokou hustotou. EBL se může stát rychlejším a méně nákladným procesem replikace nanometrových obrazců v polymerních materiálech; proces replikace byl prokázán s polykaprolaktonem (PCL) za použití horké ražby a lití rozpouštědlem . Ve studii, kterou provedli Gomez et al. (2007), mikrokanály široké 1 a 2 µm a hluboké 400 a 800 nm vytvořené pomocí EBL na PDMS prokázaly, že zesilují tvorbu axonů hippocampálních buněk v kultuře více než imobilizované chemické narážky.

Rentgenová litografie je další metodou pro vytváření uspořádaných obrazců, které lze použít ke zkoumání úlohy, kterou hraje topografie při podpoře neuritogeneze. Parametry masky určují periodicitu vzoru, ale šířka a hloubka hřebene jsou určeny podmínkami leptání. Ve studii byly vytvořeny hřebeny s periodami od 400 do 4000 nm, šířkami od 70 do 1900 nm a hloubkou drážky 600 nm; vyvíjející se neurity prokázaly kontaktní vedení s tak malými rysy, jako je 70 nm a více než 90% neuritů bylo do 10 stupňů rovnoběžného zarovnání s hřebeny a drážkami. Nebyl významný rozdíl v orientaci s ohledem na použité velikosti funkcí. Počet neuritů na buňku byl omezen hřebeny a drážkami, které vytvářely bipolární spíše než rozvětvené fenotypy.

Neuspořádané topografie jsou obecně vytvářeny procesy, ke kterým dochází spontánně během jiného zpracování; vzory jsou náhodné v orientaci a organizaci s nepřesnou nebo žádnou kontrolou geometrie prvků. Výhodou vytváření neuspořádaných topografií oproti objednaným je, že procesy jsou často méně časově náročné, méně nákladné a nevyžadují velké dovednosti a zkušenosti. Neuspořádané topografie lze vytvořit demixováním polymerů, koloidní litografií a chemickým leptáním.

Při demixování polymerů dochází u polymerních směsí k spontánní separaci fází; často k tomu dochází za podmínek, jako je rotační lití na křemíkové oplatky. Mezi funkce, které lze touto metodou vytvořit, patří nanoúrovňové jámy, ostrůvky a pásky, které lze do určité míry ovládat úpravou poměru polymeru a koncentrace za účelem změny tvaru a velikosti prvku. V horizontálním směru není mnoho ovládání, ačkoli vertikální směr prvků lze přesně ovládat. Protože je vzor horizontálně velmi neuspořádaný, lze tuto metodu použít pouze ke studiu interakcí buněk se specifickými výškovými nanotopografiemi .

Koloidní litografie je levná a lze ji použít k vytváření ploch s kontrolovanou výškou a průměrem. Nanocolliody se používají jako maska leptání jejich rozprostřením po povrchu materiálu a poté se použije bombardování iontovým paprskem nebo odpařování filmu k odleptání kolem nanokolek, čímž se vytvoří nanokolony, respektive nanopity. Konečnou povrchovou strukturu lze ovládat změnou plochy pokryté koloidy a velikostí koloidů. Oblast pokrytou koloidy lze změnit úpravou iontové síly koloidního roztoku. Tato technika je schopna vytvořit velké vzorované povrchové plochy, což je nezbytné pro aplikace tkáňového inženýrství.

Chemické leptání zahrnuje namáčení povrchu materiálu v leptadle, jako je kyselina fluorovodíková (HF) nebo hydroxid sodný (NaOH), dokud se povrch nevyleptá na požadovanou drsnost vytvořenou jámami a výčnělky v nanometrovém měřítku. Delší časy leptání vedou k drsnějším povrchům (tj. K menším povrchovým jámám a výčnělkům). Struktury se specifickou geometrií nebo organizací nelze vytvořit touto základní metodou, protože v nejlepším případě ji lze považovat za povrchovou úpravu pro změnu drsnosti povrchu. Významnými výhodami této metody je snadné použití a nízké náklady na vytvoření povrchu pomocí nanotopografií . Silikonové oplatky byly leptány pomocí HF a bylo prokázáno, že adheze buněk byla zvýšena pouze ve specifikovaném rozsahu drsnosti (20–50 nm).

Chemické narážky

Kromě vytváření topografie s fyzikálními podněty může být vytvořena s chemickými podněty selektivním ukládáním roztoku polymeru ve vzorcích na povrch substrátu. Existují různé způsoby ukládání chemických narážek. Dvě metody pro dávkování chemických roztoků zahrnují pruhování a piezoelektrické mikrodispergování.

Polymerní fólie s pruhovým vzorem lze vytvářet na pevných substrátech odléváním zředěného polymerního roztoku. Tato metoda je relativně snadná, levná a nijak neomezuje materiály lešení, které lze použít. Tento postup zahrnuje vodorovně se překrývající skleněné desky, přičemž je udržuje svisle oddělené úzkou mezerou vyplněnou roztokem polymeru. Horní deska se pohybuje konstantní rychlostí mezi 60 a 100 µm/s. Po odpaření rozpouštědla se na okraji kluzného skla kontinuálně vytváří tenký kapalný film roztoku. Pruhové vzory připravené rychlostí 60, 70 a 100 µm/s vytvořily šířku a rozteč drážek 2,2 a 6,1 µm, 3,6 a 8,4 µm, respektive 4,3 a 12,7 µm; rozsah výšek pro hřebeny byl 50–100 nm. Tsuruma, Tanaka a kol. prokázali, že embryonální nervové buňky kultivované na filmu potaženém poly-L-lysinem připojeným a prodlouženým rovnoběžně s pruhy poly (e-kaprolakton)/chloroform (1 g/l) s úzkou šířkou a roztečí vzoru (šířka: 2,2 µm, rozteč: 6,1 µm). Neurony však rostly přes osu obrazců se širokou šířkou a rozestupy (šířka: 4,3 µm, rozteč: 12,7 µm). V průměru měly neurony na filmech s pruhovým vzorem méně neuritů na buňku a delší neurity ve srovnání s neurony na filmech bez vzoru. Parametry proužkového vzoru jsou tedy schopny určit směr růstu, délku neuritů a počet neuritů na buňku.

Mikrodispergování bylo použito k vytvoření mikro vzorků na polystyrenových kultivačních miskách dávkováním kapiček roztoků adhezivního lamininu a nelepivého bovinního sérového albuminu (BSA). Mikrodispergátor je piezoelektrický prvek připevněný k tlačné tyči na vrcholu kanálu vyleptaného silikonem, který má na každém konci jeden vstup a uprostřed trysku. Piezoelektrický prvek expanduje, když je aplikováno napětí, což způsobuje, že kapalina je dávkována tryskou. Mikrodávič se přesouvá pomocí počítače xy stolu řízeného počítačem. Rozlišení mikropatronty závisí na mnoha faktorech: viskozita vydávané kapaliny, rozteč kapek (vzdálenost mezi středem dvou sousedních kapiček v řadě nebo poli) a substrát. S rostoucí viskozitou se linie ztenčují, ale pokud je viskozita kapaliny příliš vysoká, kapalinu nelze vytlačit. Zahřátím roztoku se vytvoří rovnoměrnější proteinové linie. Ačkoli je pro vytvoření souvislých čar nutné určité překrývání kapiček, nerovnoměrné odpařování může způsobit nerovnoměrnou koncentraci proteinu podél linií; tomu lze zabránit plynulejším odpařováním úpravou vlastností dávkovaného roztoku.

U vzorků obsahujících 0,5 mg/ml lamininu rostl vyšší podíl neuritů na mikrodisperzních liniích než mezi řádky. Na 10 mg/ml a 1 mg/ml BSA proteinových vzorcích a BSA proteinových vzorcích bez mastných kyselin se značný počet neuritů vyhnul proteinovým liniím a rostl mezi řádky. BSA linie obsahující mastné kyseliny tedy byly stejně nepropustné pro růst neuritů jako linie obsahující BSA s mastnými kyselinami. Protože mikrodispenze nevyžaduje přímý kontakt s povrchy substrátu, může tato technika využít povrchy s jemnou mikro- nebo nanotopologií, které by mohly být zničeny kontaktem. Množství uloženého proteinu je možné měnit dávkováním více či méně kapiček. Výhodou mikrodispergování je, že vzory lze vytvářet rychle za 5–10 minut. Protože piezoelektrický mikrodisperzátor nevyžaduje zahřívání, lze dávkovat proteiny a tekutiny citlivé na teplo i živé buňky.

Materiál lešení

Výběr materiálu lešení je možná nejdůležitější rozhodnutí, které je třeba učinit. Musí být biokompatibilní a biologicky rozložitelný; navíc musí být schopen začlenit jakékoli požadované fyzikální, chemické nebo biologické podněty, což v případě některých chemických podnětů znamená, že musí mít k dispozici místo pro chemickou vazbu peptidů a jiných molekul. Materiály lešení vybrané pro nervová vedení jsou téměř vždy hydrogely. Hydrogel může být složen buď z biologických nebo syntetických polymerů. Jak biologické, tak syntetické polymery mají své silné a slabé stránky. Je důležité poznamenat, že materiál potrubí může způsobit nedostatečné zotavení, když (1) rychlost degradace a resorpce neodpovídá rychlosti tvorby tkáně, (2) vlastnosti napětí a deformace se nesrovnávají dobře s vlastnostmi nervové tkáně, (3) když dojde k degradujícímu bobtnání, způsobujícímu významnou deformaci, (4) je vyvolána velká zánětlivá reakce, nebo (5) materiál má nízkou propustnost.

Hydrogel

Hydrogely jsou třídou biomateriálů, které jsou chemicky nebo fyzikálně zesítěné ve vodě rozpustné polymery. Mohou být buď rozložitelné, nebo nedegradovatelné podle jejich chemie, ale odbouratelné je žádoucí, kdykoli je to možné. O hydrogely pro účely tkáňového inženýrství je velký zájem, protože obecně mají vysokou biokompatibilitu, mechanické vlastnosti podobné měkkým tkáním a schopnost být injektovány jako kapalina, která geluje. Když jsou hydrogely fyzicky zesíťovány, musí se při gelování spoléhat na fázovou separaci; oddělení fází je závislé na teplotě a je reverzibilní. Některé další výhody hydrogelů spočívají v tom, že používají pouze netoxická vodná rozpouštědla, umožňují infuzi živin a výstup odpadních produktů a umožňují samovolnému shromažďování buněk. Hydrogely mají nízké mezifázové napětí, což znamená, že buňky mohou snadno migrovat přes hranici tkáňového implantátu. U hydrogelů je však obtížné vytvořit širokou škálu mechanických vlastností nebo struktur s kontrolovanou velikostí pórů.

Syntetický polymer

Syntetický polymer může být nerozložitelný nebo rozložitelné. Pro účely inženýrství neurální tkáně jsou upřednostňovány degradovatelné materiály, kdykoli je to možné, protože dlouhodobé efekty, jako je zánět a jizva, by mohly vážně poškodit nervovou funkci. Rychlost degradace závisí na molekulové hmotnosti polymeru, jeho krystalinitě a poměru podjednotek kyseliny glykolové a kyseliny mléčné. Kvůli methylové skupině je kyselina mléčná více hydrofobní než kyselina glykolová, což způsobuje, že její hydrolýza je pomalejší. Syntetické polymery mají lepší mechanické vlastnosti a rychlosti degradace, které lze ovládat v širokém rozsahu, a eliminují obavy z imunogenicity. V současné době se v nervovém tkáňovém inženýrství používá mnoho různých syntetických polymerů. Nevýhody mnoha z těchto polymerů však zahrnují nedostatečnou biokompatibilitu a bioaktivitu, která brání těmto polymerům podporovat buněčné připojení, proliferaci a diferenciaci. Syntetická vedení byla klinicky úspěšná pouze při opravě velmi krátkých mezer nervových lézí menších než 1–2 cm. Kromě toho regenerace nervů pomocí těchto kanálů dosud nedosáhla úrovně funkčního zotavení pozorovaného u nervových autograftů.

Kolagen-terpolymer

Kolagen je hlavní složkou extracelulární matrix a nachází se v podpůrných tkáních periferních nervů. Terpolymer (TERP) byl syntetizován kopolymerací tří monomerů volnými radikály a zesíťován kolagenem, čímž bylo vytvořeno hybridní biologicky syntetické hydrogelové lešení. Terpolymer je na bázi poly (NIPAAM), který je známý jako polymer přátelský k buňkám. TERP se používá jak jako zesíťovač ke zvýšení odolnosti hydrogelu, tak jako místo pro roubování bioaktivních peptidů nebo růstových faktorů reakcí některých jeho akryloxysukcinimidových skupin se skupinami –NH2 na peptidech nebo růstových faktorech. Protože hydrogenu kolagen-terpolymer (kolagen-TERP) postrádá bioaktivní složku, připojila se k ní studie běžného buněčného adhezního peptidu nalezeného v lamininu (YIGSR), aby se zlepšily jeho vlastnosti adheze buněk.

Poly (kyselina mléčná-co-glykolová)

Mezi polymery v rodině PLGA patří poly (kyselina mléčná) (PLA), poly (kyselina glykolová) (PGA) a jejich kopolymer poly (kyselina mléčná-glykolová) (PLGA). Všechny tři polymery byly schváleny Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv pro použití v různých zařízeních. Tyto polymery jsou křehké a nemají oblasti přípustných chemických modifikací; navíc degradují spíše hromadně než povrchem, což není hladký a ideální degradační proces. Ve snaze překonat nedostatek funkcionalit byly do jejich struktur začleněny volné aminy, ze kterých mohou být přivázány peptidy za účelem kontroly přichycení a chování buněk.

Metakrylovaný dextran (Dex-MA) kopolymerovaný s aminoethylmethakrylátem (AEMA)

Dextran je polysacharid odvozený z bakterií; obvykle ho produkují enzymy z určitých kmenů leuconostocu nebo streptokoka . Skládá se z α-1,6 vázaných zbytků D-glukopyranosy. Zesítěné hydrogelové kuličky dextranu byly široce používány jako matrice s nízkou vazbou na proteiny pro aplikace sloupcové chromatografie a pro technologii kultivace buněk mikronosičů. Až donedávna však nebyly dextranové hydrogely zkoumány v aplikacích biomateriálů a konkrétně jako vehikula pro dodávání léčiv. Výhoda použití dextranu v aplikacích biomateriálů zahrnuje jeho odolnost vůči adsorpci proteinu a buněčné adhezi, což umožňuje určit specifickou buněčnou adhezi záměrně připojenými peptidy ze složek ECM. AEMA byla kopolymerizována s Dex-MA za účelem zavedení primárních aminových skupin za poskytnutí místa pro připojení peptidů odvozených od ECM za účelem podpory buněčné adheze. Peptidy lze imobilizovat pomocí vazebné chemie sulfo-SMMC a peptidů zakončených cysteinem. Kopolymerizace Dex-MA s AEMA umožnila kromě podpory buněčných interakcí zachovat i makroporézní geometrii lešení.

Poly (glycerol sebakát) (PGS)

Z poly (glycerol sebakátu) (PGS) byl vyvinut nový biologicky rozložitelný, houževnatý elastomer pro použití při vytváření nervového vedení. PGS byl původně vyvinut pro účely inženýrství měkkých tkání, aby specificky napodoboval mechanické vlastnosti ECM. Je považován za elastomer, protože je schopen se zotavit z deformace v mechanicky dynamických prostředích a účinně rovnoměrně distribuovat napětí ve všech regenerujících se tkáních ve formě mikro napětí. PGS se syntetizuje polykondenzační reakcí glycerolu a kyseliny sebakové, které lze zpracovat taveninou nebo zpracovat rozpouštědlem do požadovaného tvaru. PGS má Youngův modul 0,28 MPa a mezní pevnost v tahu větší než 0,5 MPa. Periferní nerv má Youngův modul přibližně 0,45 MPa, což je velmi blízko k PGS. Kromě toho dochází u PGS k degradaci povrchu doprovázené ztrátami lineární hmotnosti a pevnosti během resorpce. Po implantaci byl poločas degradace stanoven na 21 dní; úplná degradace nastala 60. den. PGS během degradace zaznamenává minimální absorpci vody a nemá detekovatelné bobtnání; otok může způsobit zkreslení, které zužuje tubulární lumen a může bránit regeneraci. Je výhodné, že doba degradace PGS se může měnit změnou stupně zesíťování a poměru kyseliny sebakové k glycerolu. Ve studii Sundback et al. (2005), implantované PGS a PLGA kanály měly podobné časné tkáňové reakce; zánětlivé reakce PLGA se však později zvýšily, zatímco zánětlivé reakce PGS nadále klesaly.

Polyethylenglykol hydrogel

Polyethylenglykolové (PEG) hydrogely jsou biokompatibilní a bylo prokázáno, že jsou tolerovány v mnoha typech tkání, včetně CNS. Mahoney a Anseth vytvořili hydrogely PEG fotopolymerizací methakrylátových skupin kovalentně spojených s degradovatelnými PEG makromery. Degradace hydrogelu byla v průběhu času monitorována měřením mechanické pevnosti (modul tlaku) a průměrné velikosti ok z údajů o poměru bobtnání. Zpočátku byly polymerní řetězce vysoce zesítěné, ale jak degradace probíhala, esterové vazby byly hydrolyzovány, což gelu nabobtnalo; modul tlaku se snižoval, jak se velikost ok zvyšovala, dokud se hydrogel úplně nerozpustil. Bylo ukázáno, že nervové prekurzorové buňky byly schopné fotoenkapsulace a kultivace na PEG gelech s minimální buněčnou smrtí. Protože velikost ok je zpočátku malá, hydrogel blokuje zánětlivé a jiné inhibiční signály z okolní tkáně. Jak se velikost ok zvyšuje, hydrogel je schopen sloužit jako lešení pro regeneraci axonů.

Biologické polymery

Použití biologických polymerů oproti syntetickým má výhody. Je velmi pravděpodobné, že budou mít dobrou biokompatibilitu a budou snadno degradovatelné, protože jsou již v nějaké formě v přírodě přítomny. Existuje však také několik nevýhod. Mají nepraktické mechanické vlastnosti a rychlosti degradace, které nelze ovládat v širokém rozsahu. Kromě toho existuje vždy možnost, že materiály přírodního původu mohou způsobit imunitní odpověď nebo obsahovat mikroby. Při výrobě přírodně odvozených materiálů bude docházet také k variacím mezi šaržemi ve velkém měřítku izolačních postupů, které nelze kontrolovat. Některé další problémy, které trápí přírodní polymery, jsou jejich neschopnost podporovat růst přes dlouhé mezery v lézi kvůli možnosti kolapsu, tvorby jizev a včasné resorpci. Přes všechny tyto nevýhody, z nichž některé lze překonat, se biologické polymery stále ukazují jako optimální volba v mnoha situacích.

Kyselina polysialová (PSA)

Kyselina polysialová (PSA) je relativně nový biokompatibilní a bioresorbovatelný materiál pro umělá nervová vedení. Jedná se o homopolymer zbytků kyseliny sialové vázaných na α2,8 a dynamicky regulovanou posttranslační modifikaci adhezní molekuly neurálních buněk (NCAM). Nedávné studie prokázaly, že polysialylovaný NCAM (polySia-NCAM) podporuje regeneraci v motorovém systému. PSA vykazuje stabilitu za podmínek buněčné kultury a umožňuje indukovanou degradaci enzymy. Nedávno bylo také objeveno, že PSA se podílí na řídících procesech, jako je neuritogeneze, hledání axonální dráhy a migrace neuroblastů. Zvířata s geneticky vyřazeným PSA exprimují smrtící fenotyp, který má neúspěšné nalezení cesty; nervy spojující obě mozkové hemisféry byly odchylné nebo chyběly. PSA je tedy životně důležitý pro správný vývoj nervového systému.

Kolagen typu I/III

Kolagen je hlavní složkou extracelulární matrix a je široce používán při regeneraci a opravě nervů. Díky své hladké mikrogeometrii a propustnosti jsou kolagenové gely schopné umožnit difúzi molekul skrz ně. Rychlost resorpce kolagenu je možné řídit zesíťováním kolagenu s polypoxidovými sloučeninami. Kromě toho kolagenová skeleta typu I/III prokázala dobrou biokompatibilitu a je schopná podporovat proliferaci Schwannových buněk. Kolagenové kanály naplněné Schwannovými buňkami používanými k překlenutí nervových mezer u potkanů však vykazovaly překvapivě neúspěšnou regeneraci nervů ve srovnání s nervovými autografty. Důvodem je, že biokompatibilita není jediným faktorem nezbytným pro úspěšnou regeneraci nervů; další parametry, jako je vnitřní průměr, vnitřní mikrotopografie, pórovitost, tloušťka stěny a hustota očkování Schwannových buněk, budou muset být prozkoumány v budoucích studiích, aby se zlepšily výsledky získané těmito kolagenovými I/III gely.

Spider hedvábné vlákno

Vlákna pavoučího vlákna podporují buněčnou adhezi, proliferaci a vitalitu. Allmeling, Jokuszies a kol. ukázal, že Schwannovy buňky se rychle a pevně připevňují k hedvábným vláknům a rostou v bipolárním tvaru; míra proliferace a přežití byla u hedvábných vláken normální.

Vlákna z pavoučího hedvábí vytvořili nervový kanál se Schwannovými buňkami a acellularizovanými xenogenními žilami. Buňky Schwann vytvořily sloupce podél hedvábných vláken v krátkém čase a sloupce byly podobné pásům Bungnera, které rostly in vivo po poranění PNS. Pavoučí hedvábí nebylo dosud v tkáňovém inženýrství používáno kvůli predátorské povaze pavouků a nízkému výtěžku hedvábí od jednotlivých pavouků. Bylo objeveno, že druh Nephila clavipes produkuje hedvábí, které je méně imunogenní než hedvábí bource morušového; má pevnost v tahu 4 x 109 N/m, což je šestinásobek meze pevnosti oceli. Protože pavoučí hedvábí je proteolyticky degradováno, nedochází během degradace k posunu pH z fyziologického pH. Mezi další výhody pavoučího hedvábí patří jeho odolnost vůči houbovému a bakteriálnímu rozkladu po celé týdny a skutečnost, že nebobtná. Struktura hedvábí také podporuje buněčnou adhezi a migraci. Sklizeň hedvábí je však stále únavný úkol a přesné složení se liší mezi druhy a dokonce i mezi jedinci stejného druhu v závislosti na stravě a prostředí. Byly pokusy o syntetickou výrobu pavoučího hedvábí. K testování proveditelnosti použití pavoučího hedvábného nervového potrubí in vitro a in vivo jsou zapotřebí další studie .

Hedvábný fibroin z bource morušového

Kromě pavouků jsou bource morušového dalším zdrojem hedvábí. Protein z Bombyx mori bource morušového je jádro fibroinového proteinu obklopen sericinu, který patří do skupiny lepidlo podobné proteiny. Fibroin byl charakterizován jako těžký řetězec s opakovanou hydrofobní a krystalizovatelnou sekvencí: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X znamená Ser nebo Tyr). Okolní sericin je více hydrofilní kvůli mnoha polárním zbytkům, ale stále má některé hydrofobní části beta listu. Hedvábí se dlouho používalo jako stehy díky své vysoké mechanické pevnosti a pružnosti a také propustnosti pro vodu a kyslík. S hedvábným fibroinem lze navíc snadno manipulovat a sterilizovat. Použití hedvábí se však zastavilo, když byly hlášeny nežádoucí imunologické reakce. Nedávno bylo zjištěno, že příčina imunologických problémů spočívá výhradně v okolním sericinu. Od tohoto objevu bylo hedvábí s odstraněným sericinem používáno v mnoha farmaceutických a biomedicínských aplikacích. Protože před použitím hedvábí je nutné odstranit sericin z okolí fibroinu, je třeba vyvinout účinný postup pro jeho odstranění, který je známý jako odmašťování. Jedna metoda odmašťování používá vroucí vodný roztok Na ₂ CO ₃ , který odstraňuje sericin bez poškození fibroinu. Yang, Chen a kol. prokázali, že tekutina z hedvábného fibroinu a extraktu z hedvábného fibroinu vykazuje dobrou biokompatibilitu se Schwannovými buňkami, bez cytotoxických účinků na proliferaci.

Chitosan

Chitosan a chitin patří do rodiny biopolymerů složených z β (1–4) navázaných N-acetyl-D-glukosaminových a D-glukosaminových podjednotek. Chitosan vzniká alkalickou N-deacetylací chitinu, který je po celulóze druhým nejhojnějším přírodním polymerem. Chitosan je biologicky rozložitelný polysacharid, který byl užitečný v mnoha biomedicínských aplikacích, jako je chelatační činidlo, nosič léčiva, membrána a aditivum pro úpravu vody. Chitosan je rozpustný ve zředěných vodných roztocích, ale sráží se do gelu při neutrálním pH. Nepodporuje dobře uchycení a proliferaci nervových buněk, ale může být vylepšeno připojením peptidu odvozeného od ECM. Chitosan také obsahuje slabé mechanické vlastnosti, jejichž překonání je náročnější.

Stupeň acetylace (DA) pro rozpustný chitosan se pohybuje od 0% do 60%, v závislosti na podmínkách zpracování. Byla provedena studie s cílem charakterizovat, jak různé DA ovlivňují vlastnosti chitosanu. Různé DA byly získány pomocí anhydridu kyseliny octové nebo alkalické hydrolýzy . Bylo zjištěno, že klesající acetylace vedla ke zvýšení pevnosti v tlaku. Biodegradace byla zkoumána pomocí lysozymu, o kterém je známo, že je hlavně zodpovědný za degradaci chitosanu in vivo hydrolyzováním jeho glykosidických vazeb a je uvolňován fagocytárními buňkami po poškození nervů. Výsledky ukazují, že v průběhu studovaného časového období došlo ke zrychlenému úbytku hmotnosti u přechodných DA ve srovnání s vysokými a nízkými DA. Když byly buňky DRG pěstovány na N-acetylovaném chitosanu, životaschopnost buněk se snižovala se zvyšujícím se DA. Chitosan má také rostoucí hustotu náboje s klesajícím DA, který je zodpovědný za větší adhezi buněk. Řízení DA chitosanu je tedy důležité pro regulaci doby degradace. Tyto znalosti by mohly pomoci při vývoji vedení nervového vedení z chitosanu.

Aragonit

Nedávno bylo prokázáno, že aragonitová lešení podporují růst neuronů z krysích hippocampů. Shany a kol. (2006) dokázali, že aragonitové matrice mohou podporovat růst astrocytických sítí in vitro a in vivo . Aragonitová lešení tedy mohou být užitečná pro opravu a regeneraci nervové tkáně. Předpokládá se, že Ca ²⁺ pocházející z aragonitu je nezbytný pro podporu adherence buněk a kontaktu buňka-buňka. To se pravděpodobně provádí pomocí adhezních molekul závislých na Ca ²⁺ , jako jsou kadheriny. Krystalické matrice aragonitu mají oproti hydrogelům mnoho výhod. Mají větší póry, což umožňuje lepší růst buněk, a materiál je bioaktivní v důsledku uvolňování Ca ²⁺ , který podporuje buněčnou adhezi a přežití. Aragonitové matrice mají navíc vyšší mechanickou pevnost než hydrogely, což jim umožňuje odolat většímu tlaku při stlačení do poraněné tkáně.

Alginát

Alginát je polysacharid, který snadno tvoří řetězce; může být zesíťován na svých karboxylových skupinách s multivalentními kationty, jako je Cu ²⁺ , Ca ²⁺ nebo Al ^3+, za vzniku mechanicky stabilnějšího hydrogelu. Algináty vápenaté tvoří polymery, které jsou biokompatibilní i neimunogenní a byly použity v aplikacích tkáňového inženýrství. Nejsou však schopni podporovat podélně orientovaný růst, který je nezbytný pro opětovné spojení proximálního konce s jeho cílem. K překonání tohoto problému byly vyvinuty anizotropní kapilární hydrogely (ACH). Vznikají superponováním vodných roztoků alginátu sodného s vodnými roztoky multivalentních kationtů ve vrstvách. Po vytvoření ionty elektrolytu difundují do vrstev polymerního roztoku a disipativní konvekční proces způsobí vysrážení iontů za vzniku kapilár. Disipativní konvekční proces má za následek opozici difúzních gradientů a tření mezi řetězci polyelektrolytů. Stěny kapilár jsou lemovány vysráženým alginátem kovu, zatímco lumen je naplněn vytlačovanou vodou.

Prang a kol. (2006) hodnotili schopnost gelů ACH podporovat směrovaný opětovný růst axonů v poraněné savčí CNS. Multivalentní ionty použité k vytvoření gelů ACH na bázi alginátu byly ionty mědi, jejichž difúze do vrstev alginátu sodného vytvořila hexagonálně strukturované anizotropní kapilární gely. Po vysrážení byl celý gel procházen podélně orientovanými kapilárami. Lešení ACH podporovala přežití dospělých NPC a vysoce orientovanou regeneraci axonů. Toto je první případ použití alginátů k výrobě anizotropních strukturovaných kapilárních gelů. Budoucí studie budou muset studovat dlouhodobou fyzickou stabilitu lešení ACH, protože regenerace axonů CNS může trvat mnoho měsíců; lešení však musí být kromě schopnosti poskytovat dlouhodobou podporu také rozložitelná. Ze všech biologických a syntetických biopolymerů zkoumaných Prang et al. (2006), pouze gely na bázi agarosy byly schopny porovnat se s lineární regenerací způsobenou lešeními ACH. Budoucí studie budou také muset prozkoumat, zda lešení ACH umožňují reinervaci cíle in vivo po poranění míchy.

Hydrogel s kyselinou hyaluronovou

Kyselina hyaluronová (HA) je široce používaným biomateriálem díky své vynikající biokompatibilitě a rozmanitosti fyziologických funkcí. Je hojný v extracelulární matrix (ECM), kde váže velké glykosaminoglykany (GAG) a proteoglykany prostřednictvím specifických interakcí HA-protein. HA také váže receptory buněčného povrchu, jako je CD44, což má za následek aktivaci intracelulárních signálních kaskád, které regulují buněčnou adhezi a motilitu a podporují proliferaci a diferenciaci. Je také známo, že HA podporuje angiogenezi, protože její degradační produkty stimulují proliferaci a migraci endoteliálních buněk. HA tedy hraje klíčovou roli při udržování normálních procesů nezbytných pro přežití tkáně. Nemodifikovaná HA byla použita v klinických aplikacích, jako je oční chirurgie, hojení ran a plastická chirurgie. HA lze zesítit za vzniku hydrogelů. Hydrogely HA, které byly buď nemodifikované nebo modifikované lamininem, byly implantovány do léze dospělého centrálního nervového systému a testovány na jejich schopnost vyvolat tvorbu nervové tkáně ve studii Hou et al. Ukázali schopnost podporovat růst buněk a angiogenezi, v navíc k inhibici tvorby gliové jizvy. Také hydrogely HA modifikované lamininem byly schopné podporovat prodloužení neuritů. Tyto výsledky podporují HA gely jako slibný biomateriál pro vedení nervového vedení.

Buněčné terapie

Kromě materiálu lešení a fyzických podnětů mohou být biologické podněty také začleněny do bioartificiálního nervového potrubí ve formě buněk. V nervovém systému existuje mnoho různých typů buněk, které pomáhají podporovat růst a udržování neuronů. Tyto buňky se souhrnně nazývají gliové buňky. Gliové buňky byly zkoumány ve snaze porozumět mechanismům, které stojí za jejich schopnostmi podporovat regeneraci axonů. Jsou diskutovány tři typy gliových buněk: Schwannovy buňky, astrocyty a buňky čichového opláštění. Kromě gliových buněk mají kmenové buňky také potenciální přínos pro opravu a regeneraci, protože mnohé z nich jsou schopné diferenciace na neurony nebo gliové buňky. Tento článek stručně pojednává o použití dospělých, transdiferencovaných mezenchymálních, ektomesenchymových, nervových a nervových progenitorových kmenových buněk.

Gliové buňky

Gliové buňky jsou nezbytné pro podporu růstu a udržení neuronů v periferním a centrálním nervovém systému. Většina gliových buněk je specifická buď pro periferní nebo centrální nervový systém. Buňky Schwann jsou umístěny v periferním nervovém systému, kde myelinizují axony neuronů. Astrocyty jsou specifické pro centrální nervový systém; poskytují živiny, fyzickou podporu a izolaci pro neurony. Také tvoří hematoencefalickou bariéru. Buňky čichového opláštění však překračují hranici CNS-PNS, protože vedou neurony čichových receptorů z PNS do CNS.

Schwannovy buňky

Schwannovy buňky (SC) jsou zásadní pro regeneraci periferních nervů; hrají jak strukturální, tak funkční role. Schwannovy buňky jsou zodpovědné za účast jak na Wallerianské degeneraci, tak na pásmech Bungnera. Když je poškozený periferní nerv, Schwannovy buňky mění svou morfologii, chování a proliferaci, aby se zapojily do Wallerianské degenerace a Bungnerových pásem. Při Wallerianské degeneraci rostou Schwannovy buňky v uspořádaných sloupcích podél endoneuriální trubice a vytvářejí pás Bungnera (boB), který chrání a zachovává endoneuriální kanál. Navíc uvolňují neurotrofické faktory, které zvyšují opětovný růst ve spojení s makrofágy. Použití Schwannových buněk v inženýrství neurální tkáně má určité nevýhody; například je obtížné selektivně izolovat Schwannovy buňky a po izolaci vykazují špatnou proliferaci. Jedním ze způsobů, jak tuto obtíž překonat, je uměle indukovat jiné buňky, jako jsou kmenové buňky, do fenotypů podobných SC.

Eguchi a kol. (2003) zkoumali použití magnetických polí za účelem zarovnání Schwannových buněk. Použili supravodivý magnet horizontálního typu, který ve svém středu vytváří pole 8 T. Do 60 hodin po expozici se Schwannovy buňky zarovnaly rovnoběžně s polem; během stejného intervalu nebyly Schwannovy buňky exponovány orientovány náhodným způsobem. Předpokládá se, že rozdíly v citlivosti magnetických polí na membránové komponenty a cytoskeletální prvky mohou způsobit magnetickou orientaci. Kolagenová vlákna byla také vystavena magnetickému poli a během 2 hodin byla zarovnána kolmo na magnetické pole, zatímco kolagenová vlákna vytvářela náhodný síťový vzor bez expozice magnetického pole. Při kultivaci na kolagenových vláknech se Schwannovy buňky zarovnaly podél magneticky orientovaného kolagenu po dvou hodinách expozice magnetického pole 8-T. Naproti tomu Schwannovy buňky se náhodně orientovaly na kolagenová vlákna bez expozice magnetického pole. Kultura na kolagenových vláknech tedy umožnila orientaci Schwannových buněk kolmo na magnetické pole a jejich orientaci mnohem rychleji.

Tato zjištění mohou být užitečná pro zarovnání Schwannových buněk při poranění nervového systému, aby se podpořila tvorba pásů Bungnera, které jsou klíčové pro udržení endoneuriální trubice, která navádí znovu rostoucí axony zpět k jejich cílům. Je téměř nemožné zarovnat Schwannovy buňky pomocí externích fyzikálních technik; objev alternativní techniky pro zarovnání je tedy významný. Vyvinutá technika má však stále své nevýhody, a sice to, že k dlouhodobému udržení magnetického pole je zapotřebí značné množství energie.

Byly provedeny studie s cílem zlepšit migrační schopnost Schwannových buněk. Migrace Schwannových buněk je regulována integriny s molekulami ECM, jako je fibronektin a laminin. Kromě toho je známo, že molekula adheze neurálních buněk ( NCAM ) zvyšuje pohyblivost Schwannových buněk in vitro . NCAM je glykoprotein, který je exprimován na membránách axonálních a Schwannových buněk. Kyselina polysialová (PSA) je syntetizována na NCAM polysialyltransferázou (PST) a sialyltransferázou X (STX). Během vývoje CNS je exprese PSA na NCAM upregulována až do postnatálních fází. V mozku dospělých se však PSA nachází pouze v oblastech s vysokou plasticitou . Exprese PSA se nevyskytuje na Schwannových buňkách.

Lavdas a kol. (2006) zkoumali, zda trvalá exprese PSA na Schwannových buňkách zvyšuje jejich migraci. Buňky Schwann byly transdukovány retrovirovým vektorem kódujícím STX, aby se indukovala exprese PSA. PSW-exprimující Schwannovy buňky získaly zvýšenou pohyblivost, jak bylo prokázáno v testu přemosťování mezer a po roubování v postnatálních kulturách řezů předního mozku. Exprese PSA nemění molekulární a morfologickou diferenciaci. PSW-exprimující Schwannovy buňky byly schopné myelinizovat axony CNS v mozečkových řezech, což in vivo není normálně možné . Je nadějné, že tyto Schwannovy buňky exprimující PSA budou schopny migrovat v CNS bez ztráty myelinizačních schopností a mohou se stát užitečné pro regeneraci a myelinizaci axonů v centrálním nervovém systému.

Astrocyty

Astrocyty jsou gliové buňky, které se hojně vyskytují v centrálním nervovém systému. Jsou klíčové pro metabolickou a trofickou podporu neuronů; astrocyty navíc zajišťují pufrování iontů a odstraňování neurotransmiterů. Rostoucí axony jsou vedeny narážkami vytvořenými astrocyty; astrocyty tedy mohou regulovat hledání neuritů a následně vzorování ve vyvíjejícím se mozku. Gliová jizva, která se tvoří po poranění v centrálním nervovém systému, je tvořena astrocyty a fibroblasty ; je to nejvýznamnější překážka regenerace. Gliální jizva se skládá z hypertrofovaných astrocytů, pojivové tkáně a ECM. Dva cíle inženýrství neurální tkáně jsou porozumět funkci astrocytů a vyvinout kontrolu nad astrocytickým růstem. Studie Shany et al. (2006) prokázali, že ve 3D aragonitových matricích se ve srovnání s konvenčními 2D buněčnými kulturami zvyšuje míra přežití astrocytů. Schopnost buněčných procesů protáhnout se křivkami a póry umožňuje vytvoření více vrstev buněk se složitými 3D konfiguracemi.

Tři odlišné způsoby, kterými buňky získaly 3D tvar, jsou:

přilnutí k povrchu a sledování 3D obrysu
protažení některých procesů mezi 2 zakřiveními
rozšíření procesů ve 3D v buněčných vrstvách, pokud jsou umístěny ve vícevrstvé tkáni

V konvenční buněčné kultuře je růst omezen na jednu rovinu, což způsobuje tvorbu monovrstvy, kdy se většina buněk dotýká povrchu; 3D zakřivení povrchu aragonitu však umožňuje vývoj více vrstev a vzájemné kontakty astrocytů daleko od sebe. Je důležité podporovat tvorbu procesu podobnou podmínkám 3D in vivo , protože morfologie astrocytických procesů je zásadní pro vedení směrovosti regenerujících axonů. Topografie aragonitu poskytuje vysoký poměr povrchové plochy k objemu a postrádá hrany, což vede ke snížení efektu okraje kultury. Krystalické matrice, jako je zde uvedený aragonit, jsou povoleny pro podporu komplexní tvorby 3D tkáně, která se blíží podmínkám in vivo .

Buňky čichového opláštění

Savčí primární čichový systém si zachoval schopnost nepřetržité regenerace v dospělosti. Neurony čichových receptorů mají průměrnou životnost 6–8 týdnů, a proto musí být nahrazeny buňkami odlišenými od kmenových buněk, které jsou ve vrstvě na základně blízkého epitelu. Nové neurony čichových receptorů musí promítnout své axony přes CNS do čichové bulby , aby byly funkční. Axonální růst je kromě přítomnosti čichových obalových buněk (OEC) řízen gliovým složením a cytoarchitekturou čichového bulbu .

Předpokládá se, že OEC pocházejí z čichového kódu , což naznačuje jiný vývojový původ než jiné podobné mikroglie nervového systému.

Další zajímavý koncept je, že OEC se nacházejí v částech periferního i centrálního nervového systému primárního čichového systému, tj. Čichového epitelu a bulbu.

OEC jsou podobné Schwannovým buňkám v tom, že po úrazech poskytují upregulaci nízkoafinitního NGF receptoru p75 ; na rozdíl od Schwannových buněk však produkují nižší hladiny neurotrofinů . Několik studií ukázalo důkazy o tom, že OEC jsou schopné podporovat regeneraci poškozených axonů, ale tyto výsledky často nelze reprodukovat. Bez ohledu na to byly OEC důkladně prozkoumány ve vztahu k poraněním míchy, amyotrofické laterální skleróze a dalším neurodegenerativním onemocněním. Vědci naznačují, že tyto buňky mají jedinečnou schopnost remyelinovat zraněné neurony.

OEC mají vlastnosti podobné vlastnostem astrocytů , z nichž oba byly identifikovány jako náchylné k virové infekci.

Kmenové buňky

Kmenové buňky se vyznačují schopností prodloužení sebeobnovy po delší dobu a stále si zachovávají schopnost diferenciace podél jedné nebo více linií buněk. Kmenové buňky mohou být unipotentní, multipotentní nebo pluripotentní, což znamená, že se mohou diferencovat na jeden, více nebo všechny typy buněk. Pluripotentní kmenové buňky se mohou stát buňkami odvozenými z kterékoli ze tří zárodečných zárodečných vrstev. Kmenové buňky mají výhodu oproti gliovým buňkám, protože jsou schopny snadněji proliferovat v kultuře. Je však stále obtížné přednostně odlišit tyto buňky na různé typy buněk uspořádaným způsobem. Dalším problémem kmenových buněk je nedostatek přesně definované definice kmenových buněk mimo hematopoetické kmenové buňky (HSC). Každý „typ“ kmenových buněk má více než jednu metodu pro identifikaci, izolaci a rozšiřování buněk; to způsobilo velký zmatek, protože všechny kmenové buňky „typu“ (nervové, mezenchymové, sítnicové) se nemusí nutně chovat stejným způsobem za stejných podmínek.

Kmenové buňky pro dospělé

Dospělé kmenové buňky nejsou schopny proliferovat a diferencovat se tak účinně in vitro, jako jsou schopny in vivo . Dospělé kmenové buňky mohou pocházet z mnoha různých míst tkáně, ale je obtížné je izolovat, protože jsou definovány chováním, a nikoli povrchovými markery. Je třeba vyvinout metodu pro jasné rozlišení mezi kmenovými buňkami a diferencovanými buňkami, které je obklopují. Povrchové markery však lze do určité míry stále používat k odstranění většiny nežádoucích diferencovaných buněk. Plasticita kmenových buněk je schopnost rozlišovat přes hranice embryonálních zárodečných linií. Přítomnost plasticity však byla velmi sporná. Někteří tvrdí, že plasticita je způsobena heterogenitou mezi buňkami nebo událostmi fúze buněk. V současné době lze buňky diferencovat napříč buněčnými liniemi s výtěžky v rozmezí od 10% do 90% v závislosti na použitých technikách. Pro standardizaci výtěžku pomocí transdiferenciace je třeba provést více studií. Transdiferenciace multipotentních kmenových buněk je potenciálním prostředkem pro získání kmenových buněk, které nejsou k dispozici nebo je nelze snadno získat u dospělých.

Mezenchymální kmenové buňky

Mezenchymální kmenové buňky jsou dospělé kmenové buňky, které se nacházejí v kostní dřeni; jsou schopni se diferencovat na linie mezodermálního původu. Některé příklady tkání, které tvoří, jsou kosti , chrupavky , tuk a šlachy . MSC se získávají aspirací kostní dřeně. Růst MSC podporuje mnoho faktorů, včetně: růstového faktoru z krevních destiček , epidermálního růstového faktoru β a inzulínu podobného růstového faktoru-1 . Kromě svých normálních diferenciačních cest lze MSC transdiferencovat podél nemesenchymálních linií, jako jsou astrocyty, neurony a myelinizační buňky PNS. MSC jsou potenciálně užitečné pro strategie regenerace nervů, protože:

jejich použití není etickým problémem
není nutná žádná imunosuprese
jsou bohatým a dostupným zdrojem
tolerují genetické manipulace

Keilhoff a kol. (2006) provedli studii porovnávající schopnost regenerace nervů nediferencovaných a transdiferencovaných MSC se Schwannovými buňkami u devitalizovaných svalových štěpů přemosťujících 2 cm mezeru v sedacím nervu potkanů. Všechny buňky byly autologní. Transdiferencované MSC byly kultivovány ve směsi faktorů, aby se podpořila tvorba buněk podobných Schwannovým buňkám. Nediferencované MSC nevykazovaly žádnou regenerační kapacitu, zatímco transdiferencované MSC vykazovaly určitou regenerační kapacitu, i když nedosahovaly kapacity Schwannových buněk.

Ektomesenchymální kmenové buňky

Obtížnost izolace Schwannových buněk a následné vyvolání proliferace je velkou překážkou. Řešením je selektivní indukce buněk, jako jsou ektomesenchymální kmenové buňky (EMSC), do fenotypů podobných Schwannovým buňkám. EMSC jsou buňky neurální lišty, které migrují z lebeční neurální lišty do prvního ramenního oblouku během časného vývoje periferního nervového systému. EMSC jsou multipotentní a mají schopnost sebeobnovy. Lze je považovat za Schwannovy progenitorové buňky, protože jsou spojeny s ganglionem dorzálních kořenů a vývojem motorických nervů. EMSC diferenciace se zdá být regulována vnitřními genetickými programy a extracelulárních signálů v okolním prostředí. Schwannovy buňky jsou zdrojem neurotropních i neurotrofních faktorů nezbytných pro regeneraci nervů a lešení pro vedení růstu. Nie, Zhang a kol. provedla studii zkoumající výhody kultivace EMSC v PLGA kanálech. Přidání foskolinu a BPE do kultury EMSC způsobilo tvorbu prodloužených buněčných procesů, což je u Schwannových buněk in vitro běžné . Foskolin a BPF tedy mohou indukovat diferenciaci na fenotypy podobné Schwannovým buňkám. BPE obsahuje cytokiny GDNF , základní fibroblastový růstový faktor a růstový faktor odvozený od destiček , které způsobují diferenciaci a proliferaci gliových a Schwannových buněk aktivací MAP kináz . Když byly EMSC implantovány do kanálků PLGA, udržovaly si dlouhodobé přežití a podporovaly regeneraci periferních nervů přes 10 mm mezeru, která obvykle vykazuje malou až žádnou regeneraci. Ve štěpech byly přítomny myelinizované axony a uvnitř myelinu byly vytvořeny bazální lamely. Tato pozorování naznačují, že EMSC mohou podporovat myelinizaci regenerovaných nervových vláken v potrubí.

Nervové progenitorové buňky

Vložení neuronů do bioartificiálního nervového kanálu se jeví jako nejzjevnější metoda nahrazení poškozených nervů; neurony však nejsou schopny se množit a v kultuře mají často krátké trvání. Neurální progenitorové buňky jsou tedy slibnějšími kandidáty na náhradu poškozených a degenerovaných neuronů, protože se samy obnovují, což umožňuje in vitro produkci mnoha buněk s minimálním dárcovským materiálem. Aby se potvrdilo, že nové neurony vytvořené z neurálních progenitorových buněk jsou součástí funkční sítě, je nutná přítomnost tvorby synapsí. Studie Ma, Fitzgerald et al. je první ukázkou funkční synapse a tvorby neuronové sítě odvozené z myší neurální kmenové a progenitorové buňky na 3D kolagenové matrici. Nervové progenitorové buňky expandovaly a spontánně se diferencovaly na excitovatelné neurony a vytvářely synapse; dále si zachovali schopnost diferenciace do tří linií nervové tkáně. Bylo také prokázáno, že došlo nejen k aktivní recyklaci synaptických vezikul, ale také k tomu, že byla vytvořena excitační a inhibiční spojení schopná spontánně generovat akční potenciály. Neurální progenitorové buňky jsou tedy životaschopným a relativně neomezeným zdrojem pro vytváření funkčních neuronů.

Neurální kmenové buňky

Neurální kmenové buňky (NSC) mají schopnost sebeobnovy a diferenciace na neuronální a gliové linie. Pro směrování diferenciace NSC bylo vyvinuto mnoho kulturních metod; vytváření biomateriálů pro směrování diferenciace NSC je však považováno za klinicky relevantnější a použitelnější technologii. Jedním z přístupů k vývoji biomateriálu pro směrování diferenciace NSC je kombinace složek extracelulární matrix (ECM) a růstových faktorů. Velmi nedávná studie Nakajima, Ishimuro et al. zkoumali účinky různých molekulárních párů sestávajících z růstového faktoru a složky ECM na diferenciaci NSC na astrocyty a neuronální buňky. Zkoumanými komponentami ECM byly laminin-1 a fibronektin, což jsou přírodní složky ECM, a ProNectin F plus (Pro-F) a ProNectin L (Pro-L), což jsou umělé složky ECM, a poly (ethylenimin) (PEI). Tyto neurotrofické faktory byly použity pro epidermální růstový faktor (EGF), růstový faktor fibroblastů -2 (FGF-2), nervový růstový faktor (NGF), neurotrofin-3 (NT-3), a ciliární neurotrofní faktor (CNTF). Dvojice kombinací byla imobilizována na maticová buněčná pole, na kterých byly kultivovány NSC. Po 2 dnech kultivace byly buňky barveny protilátkami proti nestinu , p- tubulinu III a GFAP , což jsou markery pro NSC, neuronální buňky a astrocyty. Výsledky poskytují cenné informace o výhodných kombinacích složek ECM a růstových faktorů jako praktické metody pro vývoj biomateriálu pro směrování diferenciace NSC.

Neurotrofní faktory

V současné době jsou neurotrofické faktory intenzivně studovány pro použití v bioartificiálních nervových kanálech, protože jsou nezbytné in vivo pro řízení růstu a regenerace axonů. Ve studiích se neurotrofické faktory obvykle používají ve spojení s jinými technikami, jako jsou biologické a fyzické podněty vytvořené přidáním buněk a specifických topografií. Neurotrofické faktory mohou, ale nemusí být imobilizovány do struktury lešení, ačkoli je upřednostňována imobilizace, protože umožňuje vytvoření trvalých, kontrolovatelných gradientů. V některých případech, jako jsou neurální systémy pro dodávání léčiv , jsou volně imobilizovány, takže mohou být selektivně uvolňovány ve specifikovaných časech a ve specifikovaných množstvích. Podávání léčiv je dalším krokem nad rámec základního přidání růstových faktorů do nervových vodících vedení.

Biomimetické materiály

Mnoho biomateriálů používaných pro nervová vedení je biomimetický materiál . Biomimetické materiály jsou materiály, které byly navrženy tak, aby vyvolávaly specifickou buněčnou odpověď zprostředkovanou interakcemi s peptidy vázanými na lešení z proteinů ECM; v podstatě inkorporace peptidů vázajících se na buňky do biomateriálů prostřednictvím chemické nebo fyzikální modifikace.

Synergismus

Synergismus často nastává, když se spojí dva prvky; je to interakce mezi dvěma prvky, která způsobuje účinek větší než kombinované efekty každého prvku zvlášť. Synergismus je evidentní při kombinaci materiálu lešení a topografie s buněčnými terapiemi, neurotrofickými faktory a biomimetickými materiály. Vyšetřování synergismu je dalším krokem poté, co se jednotlivé techniky samy osvědčily jako úspěšné. Kombinace těchto různých faktorů je třeba pečlivě prostudovat, aby se optimalizovaly synergické efekty.

Optimalizace kombinací neurotrofických faktorů

Předpokládalo se, že interakce mezi neurotrofickými faktory mohou změnit optimální koncentrace každého faktoru. Zatímco přežití buněk a udržování fenotypu jsou důležité, důraz byl kladen na rozšíření neuritů. Kombinace NGF , neurotrofního faktoru odvozeného z gliové buněčné linie ( GDNF ) a ciliárního neurotrofního faktoru ( CNTF ) byla prezentována kulturám gangliových kořenů dorzálních kořenů in vitro . Byl použit jeden faktor z každé neurotrofní rodiny. Bylo zjištěno, že neexistuje rozdíl v individuální optimální koncentraci a kombinační optimální koncentraci; kolem 5. nebo 6. dne však neurity přestaly prodlužovat a začaly degradovat. Předpokládalo se, že je to kvůli nedostatku kritické živiny nebo správných gradientů; předchozí studie ukázaly, že růstové faktory jsou schopny optimalizovat rozšíření neuritů nejlépe, pokud jsou prezentovány v gradientech. Budoucí studie kombinací neurotrofických faktorů budou muset zahrnovat gradienty.

Kombinace adhezních molekul neurálních buněk a GFD-5

Molekuly adheze buněk (CAM) a neurotrofické faktory vložené dohromady do biokompatibilních matric jsou relativně novým zkoumaným konceptem. Obzvláště slibné jsou CAM superrodiny imunoglobulinů (IgSF), která zahrnuje L1/NgCAM a neurofascin, protože jsou exprimovány ve vyvíjejícím se nervovém systému na neuronech nebo Schwannových buňkách. Je známo, že slouží jako vodítka a zprostředkovávají neuronální diferenciaci. Neurotrofní faktory, jako je NGF a růstový diferenciační faktor 5 (GDF-5), jsou však dobře zavedeny jako promotory regenerace in vivo . Nedávná studie Niere, Brown a kol. zkoumali synergické efekty kombinace L1 a neurofascinu s NGF a GDF-5 na DRG neurony v kultuře; tato kombinace zlepšila růst neuritů. Další zlepšení bylo prokázáno kombinací L1 a neurofascinu do umělého fúzního proteinu, což zlepšuje účinnost, protože faktory nejsou dodávány jednotlivě. Lze použít nejen různé tága, ale dokonce je lze spojit do jediného „nového“ tága.

Topografie v synergii s chemickými a biologickými narážkami

Účinek prezentace více typů podnětů, jako jsou chemické, fyzikální a biologické podněty, na diferenciaci nervových progenitorových buněk nebyl zkoumán. Byla provedena studie, ve které byly dospělým potkaním hippocampálním progenitorovým buňkám (AHPC) prezentovány tři různé podněty: postnatální krysí astrocyty typu 1 (biologické), lamininové (chemické) a mikropatternované substráty (fyzické). Více než 75% AHPC bylo zarovnáno do 20 ° od drážek ve srovnání s náhodným růstem na vzorcích bez vzoru. Když byly AHPC pěstovány na mikropatternovaných substrátech s astrocyty, byl růst ovlivněn astrocyty, které byly zarovnány s drážkami; jmenovitě AHPC rozšířily procesy podél astrocytových cytoskeletálních vláken. Zarovnání však nebylo tak významné, jako bylo pozorováno AHPC v kultuře samotné se substrátem s mikropatternami. Aby bylo možné posoudit různé fenotypy vyjádřené v důsledku diferenciace, byly buňky obarveny protilátkami proti beta-tubulinu třídy III (TuJI), proteinem interagujícím s receptorem (RIP) a proteinem gliálních fibrilárních kyselin (GFAP), které jsou markery pro časné neurony, oligodendrocyty, respektive astrocyty. Největší množství diferenciace bylo pozorováno u AHPC kultivovaných na vzorovaných substrátech s astrocyty.

Languages

In other projects