Perfuze stroje - Machine perfusion

Machine perfusion (MP) je technika používaná při transplantaci orgánů jako prostředek pro zachování orgánů, které mají být transplantovány.

Strojní perfúze má různé formy a lze ji kategorizovat podle teploty perfuzátu: studená (4 ° C) a teplá (37 ° C). Stroj perfuze byla použita k transplantaci ledviny , transplantaci jater a transplantace plic . Jedná se o alternativu k statickému skladování v chladu (SCS).

Historie technik konzervace ledvin

Schéma normotermické regionální perfuze přípravy břišních orgánů k transplantaci

Zásadním předstihem k rozvoji skladování a transplantace ledvin byla práce Alexise Carrela při vývoji metod pro vaskulární anastomózu . Carrel pokračoval popisem prvních transplantací ledvin, které byly provedeny u psů v roce 1902; Ullman nezávisle popsal podobné experimenty ve stejném roce. V těchto experimentech byly transplantovány ledviny, aniž by došlo k pokusu o skladování.

Zásadním krokem k umožnění in vitro skladování ledvin byla demonstrace reverzibilního účinku hypotermie na metabolické procesy izolovaných tkání, kterou provedl Fuhrman v roce 1943 . Předtím byly ledviny skladovány při normální tělesné teplotě pomocí krve nebo zředěných krevních perfuzátů, ale nebyly provedeny žádné úspěšné reimplantace. Fuhrman ukázal, že plátky krysí ledvinové kůry a mozku odolaly chlazení na 0,2 ° C po dobu jedné hodiny, při které byla jejich spotřeba kyslíku minimální. Když byly plátky znovu zahřáté na 37 ° C, jejich spotřeba kyslíku se vrátila k normálu.

Příznivý účinek podchlazení na ischemické intaktní ledviny prokázal Owens v roce 1955, když ukázal, že pokud byli psi ochlazeni na 23-26 ° C a jejich hrudní aorty byly uzavřeny na 2 hodiny, jejich ledviny nevykazovaly žádné zjevné poškození, když psi byli znovu zahřátí. Tento ochranný účinek hypotermie na ischemické poškození ledvin potvrdil Bogardus, který prokázal ochranný účinek povrchového ochlazení ledvin psů, jejichž renální stopky byly upnuty in situ po dobu 2 hodin. Moyer prokázal použitelnost těchto experimentů na psech na člověka tím, že prokázal stejný účinek na funkci psa a lidské ledviny ze stejných období hypotermické ischemie.

Teprve v roce 1958 se ukázalo, že neporušené ledviny psa přežijí ischemii ještě lépe, pokud budou ochlazeny na nižší teploty. Stueber ukázal, že ledviny by přežily in situ upnutí ledvinového pediklu po dobu 6 hodin, pokud by byly ledviny ochlazeny na 0-5 ° C umístěním do chladicího pláště, a Schloerb ukázal, že podobná technika s chlazením heparinizovaných psích ledvin na 2 -4 ° C poskytla ochranu po dobu 8 hodin, ale ne 12 hodin. Schloerb se také pokusil o skladování in vitro a autotransplantaci ochlazených ledvin a po 4 hodinách skladování ledvin měl jednoho dlouhodobého přeživšího, po kterém následovala reimplantace a okamžitá kontralaterální nefrektomie . Po 24hodinovém skladování ledvin a opožděné kontralaterální nefrektomii měl také téměř přeživšího psa, u kterého se vyvinula pozdní arteriální trombóza v ledvinách.

Tyto metody povrchového chlazení byly vylepšeny zavedením technik, při nichž byl cévní systém ledvin před uložením vypláchnut studenou tekutinou. To mělo za následek zvýšení rychlosti chlazení ledviny a odstranění červených krvinek z cévního systému. Kiser použil tuto techniku ​​k dosažení úspěšného 7hodinového skladování psí ledviny in vitro, když byla ledvina před skladováním propláchnuta při 5 ° C směsí dextranu a zředěné krve. V roce 1960 Lapchinsky potvrdil, že podobné doby skladování jsou možné, když uvedl, že osm psů přežilo poté, co byly jejich ledviny skladovány při teplotě 2–4 ° C po dobu 28 hodin, následovala autotransplantace a opožděná kontralaterální nefrektomie. Ačkoli Lapchinsky ve svém příspěvku neuvedl žádné podrobnosti, Humphries uvedl, že tyto experimenty zahrnovaly chlazení ledvin po dobu 1 hodiny studenou krví a poté skladování při teplotě 2–4 ° C, po kterém následovalo opětovné zahřátí ledvin po dobu 1 hodiny teplou krví na čas reimplantace. Kontralaterální nefrektomie byly odloženy o dva měsíce.

Společnost Humphries vyvinula tuto skladovací techniku ​​kontinuálním prokrvováním ledvin po celou dobu skladování. Jako perfuzát použil zředěnou plazmu nebo sérum a poukázal na nutnost nízkých tlaků perfuzátu, aby se zabránilo otokům ledvin, ale připustil, že optimální hodnoty pro takové proměnné, jako je teplota perfuzátu, Po 2 a průtok, zůstávají neznámé. Jeho nejlepšími výsledky v této době byly 2 psi, kteří přežili poté, co jim byly ledviny uloženy po dobu 24 hodin při teplotě 4–10 ° C, po které následovala autotransplantace a o několik týdnů opožděná kontralaterální nefrektomie.

Calne zpochybnil nutnost použití kontinuálních perfuzních metod tím, že prokázal, že úspěšné 12hodinové konzervace lze dosáhnout pomocí mnohem jednodušších technik. Calne měla jednu ledvinu podporující život, i když byla kontralaterální nefrektomie provedena současně s reimplantační operací. Calne pouze heparinizoval ledviny psa a poté je uložil do ledového roztoku při 4 ° C. Ačkoli se ukázalo, že je možné v jednom experimentu uchovat 17hodinové uchování, když došlo ke zpoždění nefrektomie, při 24hodinovém skladování nebylo dosaženo žádného úspěchu.

Další pokrok učinil Humphries v roce 1964, kdy upravil perfuzát použitý ve svém původním kontinuálním perfuzním systému a měl psí ledviny schopné podporovat život po 24hodinovém skladování, i když byla současně provedena okamžitá kontralaterální nefrektomie jako reimplantace. V těchto experimentech byla jako perfuzát použita autogenní krev zředěná 50% roztokem Tis-U-Sol při 10 ° C. Tlak perfuzátu byl 40 mm Hg a perfuzát pH 7,11-7,35 (při 37 ° C). K okysličování byla použita membránová plíce, aby nedošlo k poškození krve.

Při pokusu o zlepšení těchto výsledků Manax zkoumal účinek hyperbarického kyslíku a zjistil, že úspěšné 48hodinové skladování psích ledvin je možné při 2 ° C bez použití kontinuální perfúze, když byly ledviny propláchnuty dextranem / Tis-U- Roztok solu před skladováním při tlaku 7,9 atmosféry a pokud byla kontralaterální nefrektomie odložena do 2 až 4 týdnů po reimplantaci. Manax předpokládal, že hyperbarický kyslík může fungovat buď inhibicí metabolismu, nebo podporou difúze kyslíku do ledvinových buněk, ale nehlásil žádné kontrolní experimenty, aby zjistil, zda jsou jiné aspekty jeho modelu důležitější než hyperbarie.

Výrazného zlepšení doby skladování dosáhl Belzer v roce 1967, kdy uvedl úspěšné 72hodinové skladování ledvin po návratu k použití kontinuální perfúze pomocí perfuzátu na bázi psí plazmy při teplotě 8–12 ° C. Belzer zjistil, že rozhodujícím faktorem umožňujícím nekomplikovanou 72hodinovou perfúzi byla kryoprecipitace plazmy použité v perfuzátu ke snížení množství nestabilních lipoproteinů, které se jinak vysrážely z roztoku a postupně bránily cévnímu systému ledvin. Membrána oxygenátor byl také použit v systému, v dalším pokusu, aby se zabránilo denaturaci z lipo-proteinů , protože pouze 35% z lipo-proteiny byly odstraněny kryo-srážením. Perfuzát obsahoval 1 litr psí plazmy, 4 mEq síranu hořečnatého, 250 ml dextrózy, 80 jednotek inzulínu, 200 000 jednotek penicilinu a 100 mg hydrokortizonu. Kromě toho, že byl kryoprecipitován , byl perfuzát bezprostředně před použitím předfiltrován přes 0,22 mikronový filtr. Belzer používal perfuzát pH 7,4-7,5, Po 2 150–190 mm Hg a tlak perfuzátu 50–80 mm Hg systolický, ve stroji, který produkoval pulzující tok perfuzátu. Pomocí tohoto systému měl Belzer 6 psů, kteří přežili poté, co byly jejich ledviny uloženy po dobu 72 hodin a poté znovu implantovány, přičemž při reimplantačních operacích byly provedeny okamžité kontralaterální nefrektomie.

Belzerovo použití hydrokortizonu jako adjuvans ke konzervaci bylo navrženo Lotkeovou prací s plátky ledvin pro psy, ve kterých hydrokortizon zlepšil schopnost řezů vylučovat PAH a kyslík po 30 hodinách skladování při 2-4 ° C; Lotke navrhl, že v těchto experimentech může hydrokortison působit jako stabilizátor lysozomální membrány. K ostatním součástem Belzerova modelu se dospělo empiricky. Inzulín a hořčík byly použity částečně ve snaze vyvolat umělou hibernaci , protože Suomalainen shledal tento režim jako účinný při vyvolání hibernace v přírodních hibernacích. Hořčík byl také poskytován jako metabolický inhibitor poté, co Kamiyama prokázal, že je účinným činidlem při ochraně srdce psa. Dalším důvodem pro hořčík bylo, že bylo nutné nahradit vápník, který byl v plazmě vázán citrátem .

Belzer prokázal použitelnost svých psích experimentů při skladování lidských ledvin, když ohlásil své zkušenosti s transplantací ledvin za použití stejných technik skladování, jaké použil pro psí ledviny. Dokázal uchovávat ledviny až 50 hodin, pouze u 8% pacientů vyžadujících pooperační dialýzu, když byl dárce dobře připraven.

V roce 1968 hlásil Humphries 1 přeživšího ze 14 psů po 5denním skladování ledvin v perfuzním přístroji při 10 ° C za použití zředěného plazmatického média obsahujícího extra mastné kyseliny. U těchto experimentů bylo však pro dosažení úspěchu nutné opožděná kontralaterální nefrektomie 4 týdny po reimplantaci, což naznačuje, že během skladování byly ledviny vážně poškozeny.

V roce 1969 Collins ohlásil zlepšení výsledků, kterých bylo možné dosáhnout pomocí jednoduchých neperfučních metod hypotermického ukládání ledvin. Svou techniku ​​založil na pozorování Kellera, že ztrátě elektrolytů z ledviny během skladování lze zabránit použitím akumulační tekutiny obsahující kationty v množství blížícím se množství běžně přítomnému v buňkách. V Collinsově modelu byli psi před nefrektomií dobře hydratováni a byl jim také podán manitol k vyvolání diurézy. Fenoxybenzamin, vazodilatátor a stabilizátor lysozomálních enzymů, byl injikován do renální tepny před nefrektomií. Ledviny byly ihned po vyjmutí ponořeny do solného roztoku a perfundovány renální tepnou 100 - 150 ml studeného roztoku elektrolytu z výšky 100 cm. Ledviny zůstaly po zbytek doby skladování v ledovém solném roztoku. Roztok použitý pro tyto úspěšné perfuze za studena napodoboval elektrolytové složení intracelulárních tekutin tím, že obsahoval velké množství draslíku a hořčíku. Roztok také obsahoval glukózu, heparin, prokain a fenoxybenzamin. Hodnota pH roztoku byla 7,0 při 25 ° C. Collins dokázal dosáhnout úspěšného 24hodinového skladování 6 ledvin a 30hodinového skladování 3 ledvin, přičemž ledviny fungovaly okamžitě po reimplantaci, a to i přes okamžité kontralaterální nefrektomie. Collins zdůraznil špatné výsledky získané při proplachování Ringerova roztoku při hledání podobných výsledků s touto léčbou ve srovnání s ledvinami ošetřenými samotným povrchovým chlazením. Liu uvedl, že Collinsův roztok by mohl poskytnout úspěšné 48hodinové skladování, když byl roztok upraven přidáním aminokyselin a vitamínů. Liu však neprováděl žádné kontrolní experimenty, aby ukázal, že tyto modifikace byly zásadní.

Potíž našli další pracovníci v opakování úspěšných 72hodinových experimentů Belzerových perfuzních skladovacích operací. Woods dokázal dosáhnout úspěšného 48hodinového skladování 3 ze 6 ledvin, když použil aditiva Belzer s kryoprecipitovanou plazmou jako perfuzát v hypotermickém perfuzním systému, ale nebyl schopen prodloužit dobu skladování na 72 hodin, jak to udělal Belzer . Woods však později dosáhl úspěšného 3 a 7denního skladování psích ledvin. Woods upravil Belzerův perfuzát přidáním 250 mg methyl prednisolonu, zvýšil obsah síranu hořečnatého na 16,2 mEq a inzulín na 320 jednotek. Šest ze šesti ledvin produkovalo život udržující funkci, když byly znovu implantovány po 72 hodinách skladování navzdory okamžitým kontralaterálním nefrektomím; 1 ze 2 ledvin produkovala život udržující funkci po 96 hodinách skladování, 1 ze 2 po 120 hodinách skladování a 1 ze 2 po 168 hodinách skladování. Perfuzát tlak byl 60 mm Hg s perfuzátu rychlosti čerpadla 70 tepů za minutu, a Perfuzát pH se automaticky udržuje na 7,4 pomocí CO 2 titrátoru. Woods zdůraznil význam hydratace dárcovských a přijímajících zvířat. Bez methyl prednisolonu zjistil Woods problém s křehkostí cév, když doba skladování byla delší než 48 hodin.

Hlavní zjednodušení technik hypotermického skladování perfuze provedli Johnson a Claes v roce 1972 zavedením perfuzátu na bázi albuminu. Tento perfuzát eliminoval potřebu výroby kryoprecipitované a millipore filtrované plazmy používané Belzerem. Příprava tohoto perfuzátu byla pracná a časově náročná a bylo zde potenciální riziko viru hepatitidy a cytotoxických protilátek. Absence lipoproteinů z perfuzátu znamenala, že membránový oxygenátor mohl být vyloučen z perfuzního okruhu, protože nebylo nutné se vyhýbat rozhraní perfusát / vzduch, aby se zabránilo srážení lipoproteinů. Oba pracovníci používali stejné přísady, jaké doporučil Belzer.

Roztok, který Johnson použil, byl připraven laboratoří Blood Products Laboratory (Elstree: England) extrakcí tepelně labilního fibrinogenu a gama globulinů z plazmy za vzniku roztoku frakce plazmatické bílkoviny (PPF). Roztok se inkuboval při 60 ° C po dobu 10 hodin, aby se deaktivovala látka sérové ​​hepatitidy. Výsledkem byl roztok lidského albuminu o koncentraci 45 g / l obsahující malé množství gama a beta globulinů, který byl stabilní po dobu 5 let mezi 0 ° C a 30 ° C. PPF obsahoval 2,2 mmol / l volných mastných kyselin.

Johnsonovy experimenty se týkaly hlavně skladování ledvin, které byly poškozeny dlouhodobým poškozením teplem. V kontrolní skupině neohřátých poraněných psích ledvin však Johnson ukázal, že 24hodinové konzervace se snadno dosáhlo při použití perfuzátu PPF, a popsal jinde přeživšího po 72 hodinách perfuze a reimplantace s okamžitou kontralaterální nefrektomií. U teple poškozených ledvin poskytla perfúze PPF lepší výsledky než Collinsova metoda, přičemž 6 ze 6 psů přežilo po 40 minutách poranění teplem a 24hodinovém skladování s následnou reimplantací ledvin a okamžitou kontralaterální nefrektomií. Draslík, hořčík, inzulín, glukóza, hydrokortison a ampicilin byly přidány do roztoku PPF, aby poskytly zdroj energie a zabránily úniku intracelulárního draslíku. Teplota perfuzátu byla 6 ° C, tlak 40–80 mm Hg a Po 2 200–400 mm Hg. Hodnota pH byla udržována mezi 7,2 a 7,4.

Claes použil perfuzát na bázi lidského albuminu (Kabi: Švédsko) zředěný solným roztokem na koncentraci 45 g / l. Claes uchovala 4 z 5 psích ledvin po dobu 96 hodin, přičemž ledviny fungovaly bezprostředně po reimplantaci navzdory okamžitým kontralaterálním nefrektomím. Claes také porovnal tento perfuzát s Belzerovou kryoprecipitovanou plazmou v kontrolní skupině a nenalezl žádný významný rozdíl mezi funkcí reimplantovaných ledvin u obou skupin.

Jedinou další skupinou kromě Woodse, která hlásila úspěšné sedmidenní uchovávání ledvin, byli Liu a Humphries v roce 1973. Měli tři ze sedmi psů, kteří přežili, poté, co jim byly ledviny uloženy sedm dní, následovala reimplantace a okamžitá kontralaterální nefrektomie. Jejich nejlepší pes měl vrchol po reimplantaci kreatininu 50 mg / l (0,44 mmol / l). Liu použila dobře hydratované psy, kteří podstoupili manitol diurézu, a uchovávala ledviny při 9 ° C - 10 ° C pomocí perfuzátu získaného z lidského PPF. PPF byl dále frakcionován použitím vysoce ve vodě rozpustného polymeru (Pluronic F-38) a k PPF byly přidány acetyl-tryptofanát sodný a kaprylát sodný jako stabilizátory, které umožnily pasterizaci. K tomuto roztoku byl přidán lidský albumin, heparin, mannitol, glukóza, síran hořečnatý, chlorid draselný, inzulín, methyl prednisolon, karbenicilin a voda k úpravě osmolality na 300 - 310  mosmol / kg. Perfuzát byl vyměněn po 3,5 dnech skladování. Tlak perfuzátu byl 60 mm Hg nebo méně, při rychlosti čerpání 60 za minutu. PH perfuzátu bylo 7,12–7,32 (při 37 ° C), Pco2 27–47 mm Hg a Po 2 173–219 mm Hg. V další zprávě o této studii Humphries zjistil, že když byly experimenty opakovány s novou šarží PPF, nebyli získáni žádní přeživší a histologie přeživších z původního experimentu ukázala glomerulární hypercelulárnost, kterou přisuzoval možnému toxickému účinku pluronického polymeru .

Joyce a Proctor uvedli úspěšné použití jednoduchého perfuzátu na bázi dextranu pro 72hodinové skladování psích ledvin. 10 ze 17 ledvin bylo životaschopných po reimplantaci a okamžité kontralaterální nefrektomii. Joyce použila nepulzativní perfuzi při 4 ° C s perfuzátem obsahujícím 2,1% Dextranu 70 (Pharmacia) s dalšími elektrolyty, glukózou (19,5 g / l), prokainem a hydrokortizonem. Perfuzát neobsahoval žádnou plazmu ani její složky. Perfuzát tlak byl pouze 30 cm H 2 O, pH 7,34 až 7,40 a Po 2 250-400 mm Hg. Tato práce ukázala, že pro 72hodinové skladování nebyly zapotřebí žádné živiny kromě glukózy a nízké tlaky a průtoky perfuzátu byly přiměřené.

V roce 1973 Sacks ukázal, že jednoduché skladování ledu lze úspěšně použít pro 72hodinové skladování, když bylo pro počáteční ochlazení a vyplachování z ledviny použito nové proplachovací řešení. Pytle odstranily ledviny dobře hydratovaným psům, které po infuzi mannitolu diurovaly, a propláchly ledviny 200 ml roztoku z výšky 100 cm. Ledviny pak byly jednoduše udržovány při 2 ° C po dobu 72 hodin bez dalšího promývání. Po reimplantaci následovaly okamžité kontralaterální nefrektomie. Proplachovací roztok byl navržen tak, aby napodoboval složení intracelulární tekutiny a obsahoval mannitol jako nepropustný iont, aby se dále zabránilo bobtnání buněk. Osmolalita roztoku byla 430 mosmol / kg a jeho pH bylo 7,0 při 2 ° C. Přísady, které používal Collins (dextróza, fenoxybenzamin, prokain a heparin), Sacks vynechal.

Těmto výsledkům se vyrovnal Ross, který také dosáhl úspěšného 72hodinového skladování bez použití kontinuální perfuze, ačkoli nebyl schopen reprodukovat Collinsovy nebo Sackovy výsledky pomocí originálních Collinsových nebo Sacksových řešení. Rossovo úspěšné řešení bylo podobné složení elektrolytů jako intracelulární tekutina s přídavkem hypertonického citrátu a mannitolu. V roztoku nebyly přítomny žádné fosforečnany, hydrogenuhličitany, chloridy ani glukóza; osmolalita byla 400 mosmol / kg a pH 7,1. Pět z 8 psů přežilo reimplantaci ledvin a okamžitou kontralaterální nefrektomii, když byly ledviny skladovány 72 hodin poté, co byly propláchnuty Rossovým roztokem; ale Ross nebyl schopen dosáhnout 7denního skladování touto technikou, i když byla použita opožděná kontralaterální nefrektomie.

Collins uvedl, že požadavky na úspěšné 72hodinové hypotermické perfúzní skladování byly dále definovány, že pulzativní perfuze není nutná, pokud byl použit tlak perfuzátu 49 mm Hg, a že 7 ° C byla lepší teplota pro skladování než 2 ° C nebo 12 ° C. Rovněž porovnal různé složení perfuzátu a zjistil, že je možné úspěšně použít fosfátem pufrovaný perfuzát, čímž se eliminuje potřeba přísunu oxidu uhličitého. Grundmann rovněž prokázal, že nízký tlak perfuzátu je přiměřený. Použil střední pulzující tlak 20 mm Hg v 72hodinových perfúzích a zjistil, že to dává lepší výsledky než střední tlaky 15, 40, 50 nebo 60 mm Hg.

Úspěšné skladování až 8 dní bylo hlášeno společností Cohen s použitím různých typů perfuzátu - s nejlepším výsledkem bylo dosaženo při použití perfusátu pufrovaného fosfáty při 8 ° C. Předpokládalo se, že neschopnost opakovat tyto úspěšné experimenty byla způsobena změnami, které byly provedeny ve způsobu výroby PPF s vyšším obsahem kyseliny oktanové, což je škodlivé. Ukázalo se, že kyselina oktanová je schopna stimulovat metabolickou aktivitu během hypotermické perfuze, což by mohlo být škodlivé.

Povaha poškození konzervace ledvin

Strukturální zranění

Strukturální změny, které se vyskytují v průběhu 72-hodinové hypotermii skladování dříve nezraněné ledvin byly popsány Mackay, který ukázal, jak tam bylo postupné vakuolizace v cytoplasmě buněk, které zvláště postižených na proximálních tubulů . Při elektronové mikroskopii bylo pozorováno, že mitochondrie nabobtnaly s časným oddělením vnitřních cristálních membrán a následnou ztrátou veškeré vnitřní struktury. Lysozomální integrita byla dobře zachována až do pozdních hodin a nezdálo se, že by destrukce buňky byla způsobena lytickými enzymy, protože nedošlo k žádnému dalšímu poškození bezprostředně sousedícímu s lysozomy než ve zbytku buňky.

Woods a Liu - při popisu úspěšného 5 a 7denního skladování ledvin - popsali světelné mikroskopické změny pozorované na konci perfuze a po porážce, ale kromě určité infiltrace lymfocyty a příležitostné tubulární atrofie našli jen málo závažných abnormalit.

Změny během krátkých perfuzí lidských ledvin před reimplantací popsal Hill, který také provedl biopsie 1 hodinu po reimplantaci. Při elektronové mikroskopii našel Hill endoteliální poškození, které korelovalo se závažností ukládání fibrinu po reimplantaci. Změnami, které Hill viděl v glomerulech ve světelné mikroskopii, byly příležitostné fibrinové tromby a infiltrace polymorfy. Hill měl podezření, že tyto změny jsou imunologicky indukovanou lézí, ale zjistil, že neexistuje žádná korelace mezi závažností histologické léze a přítomností nebo nepřítomností imunoglobulinových depozit.

Existuje několik zpráv o analýze moči produkované ledvinami během skladování perfuze. Kastagir analyzoval moč produkovanou během 24hodinové perfúze a zjistil, že jde o ultrafiltrát perfuzátu, Scott našel stopu bílkoviny v moči během 24hodinového skladování a Pederson našel pouze stopu bílkoviny po 36hodinové perfuzi. Pederson zmínil, že během dřívějších experimentů zjistil těžkou proteinurii. Woods zaznamenal proteinové odlitky v tubulech životaschopných ledvin po 5denním skladování, ale neanalyzoval moč produkovanou během perfuze. V Cohenově studii došlo během 8denního uchovávání k postupnému zvyšování koncentrace bílkovin v moči, dokud se obsah bílkovin v moči nevyrovnal obsahu perfuzátu. To mohlo souviset s otokem glomerulárních bazálních membrán a progresivní fúzí procesů nohou epiteliálních buněk, která byla také pozorována během stejného období skladování perfúze.

Mechanismy úrazu

Mechanismy, které poškozují ledviny během podchlazení, lze rozdělit následovně:

  1. Poranění metabolických procesů buňky způsobené:
    1. Studený
    2. Anoxie, když jsou ledviny teplé před i po období podchlazení.
    3. Nedodání správných živin.
    4. Akumulace toxinů v perfuzátu.
    5. Toxické poškození akumulační kapaliny.
    6. Vymývání esenciálních substrátů z ledvinových buněk.
  2. Zranění jaderné DNA.
  3. Mechanické poškození cévního systému ledvin během hypotermické perfuze.
  4. Postimplantační poranění.

Metabolické poškození

Studený

Při normálních teplotách čerpací mechanismy v buněčných stěnách udržují intracelulární draslík na vysoké úrovni a vytlačují sodík. Pokud tato čerpadla selžou, je sodík absorbován buňkou a draslík je ztracen. Voda pasivně sleduje sodík a vede k bobtnání buněk. Důležitost této kontroly buněčného otoku prokázal McLoughlin, který zjistil významnou korelaci mezi obsahem psí ledvinné kortikální vody a schopností ledvin podporovat život po 36hodinovém skladování. Čerpací mechanismus je poháněn enzymatickým systémem známým jako Na + K + - aktivovaná ATPáza a je inhibován chladem. Levy zjistil, že metabolická aktivita při 10 ° C, jak je naznačeno měřením spotřeby kyslíku, byla snížena na přibližně 5% normálu a protože všechny enzymové systémy jsou ovlivněny podobným způsobem podchlazením, aktivita ATPázy je výrazně snížena při 10 ° C.

Existují však tkáňové a druhové rozdíly v citlivosti této ATPázy na chlad, které mohou odpovídat za rozdíly ve schopnosti tkání odolat podchlazení. Martin ukázal, že v kortikálních buňkách ledvin u psů je určitá aktivita ATPázy stále přítomna při 10 ° C, ale ne při 0 ° C. V játrech a srdečních buňkách byla aktivita úplně inhibována při 10 ° C a tento rozdíl v citlivosti ATPázy na chlad koreloval s většími potížemi při kontrole otoku buněk během hypotermického skladování jaterních a srdečních buněk. Zřetelná ATPáza se nachází ve stěnách cév, což bylo prokázáno Belzerem, že je zcela inhibována při 10 ° C, kdy je při této teplotě stále aktivní ATPáza ledvinových kortikálních buněk. Tyto experimenty byly prováděny na aortálním endotelu, ale pokud má vaskulární endotel ledviny stejné vlastnosti, pak může být limitujícím faktorem při prodlouženém skladování ledvin vaskulární poškození.

Willis ukázal, jak hibernátoři odvozují část své schopnosti přežít nízké teploty tím, že mají Na + K + -ATPázu, která je schopna aktivně transportovat sodík a draslík přes jejich buněčné membrány při 5 ° C, což je asi šestkrát rychleji než v jiných než hibernacích ; tato rychlost přenosu je dostatečná, aby se zabránilo bobtnání buněk.

Rychlost ochlazování tkáně může být také významná při produkci poškození enzymových systémů. Francavilla ukázala, že když byly jaterní plátky rychle ochlazeny (okamžité ochlazení na 12 ° C za 6 minut), byla anaerobní glykolýza, měřená při opětovném zahřátí na 37 ° C, inhibována přibližně o 67% aktivity, která byla prokázána u plátků, které byly podrobeny k opožděnému chlazení. Plátky ledvin psů však byly rychlejším ochlazením ovlivněny méně vážně než plátky jater.

Anoxia

Všechny buňky vyžadují ATP jako zdroj energie pro svou metabolickou aktivitu. Ledvina je poškozena anoxií, když ledvinové kortikální buňky nejsou schopny generovat dostatečné množství ATP za anaerobních podmínek k uspokojení potřeb buněk. Při vyříznutí ledviny je nevyhnutelná anoxie v intervalu mezi dělením renální tepny a ochlazením ledviny. Bergstrom ukázal, že 50% obsahu kortikálních buněk ledviny psa je ztraceno během 1 minuty po upnutí renální arterie a podobné výsledky našel Warnick v ledvinách celých myší s poklesem buněčného ATP o 50% po asi 30 sekund teplé anoxie. Warnick a Bergstrom také ukázali, že chlazení ledviny bezprostředně po odstranění výrazně snížilo další ztrátu ATP. Když byly tyto ledviny nepoškozené teplem perfundovány okysličenou podchlazenou plazmou, hladiny ATP byly sníženy o 50% po 24hodinovém skladování a po 48 hodinách byly průměrné hladiny ATP v tkáních o něco vyšší než toto, což naznačuje, že došlo k syntéze ATP. Pegg ukázal, že králičí ledviny mohou resyntetizovat ATP po období skladování perfuze po poranění teplem, ale u ledvin bez poranění teplem nedošlo k žádné resyntéze.

Teplá anoxie může také nastat během reimplantace ledviny po skladování. Lannon měřením metabolismu sukcinátu ukázal, jak byla ledvina citlivější na období teplé hypoxie po skladování než na stejné období teplé hypoxie, které nastalo bezprostředně před skladováním.

Nedostatek základních živin

Aktivní metabolismus glukózy s produkcí bikarbonátu prokázali Pettersson a Cohen.

Petterssonovy studie se zabývaly metabolismem glukózy a mastných kyselin ledvinami během 6denního skladování hypotermické perfuze a zjistil, že ledviny konzumovaly glukózu v dávce 4,4 μmol / g / den a mastné kyseliny v dávce 5,8 μmol / g / den. V Cohenově studii spotřebovaly nejlepší 8denní uchovávané ledviny glukózu rychlostí 2,3 μmol / g / den, respektive 4,9 μmol / g / den, což způsobilo, že užívali mastné kyseliny podobným způsobem jako ledviny Petterssonových psů. Stálost rychlosti spotřeby glukózy i rychlosti produkce hydrogenuhličitanu znamenala, že žádné poškození nemělo vliv na systémy glykolytického enzymu nebo enzymu karboanhydrázy.

Lee prokázal, že mastné kyseliny jsou preferovaným substrátem králičí ledvinové kůry při normotermických teplotách a glukóza je preferovaným substrátem pro dřeňové buňky, které se běžně metabolizují anaerobně. Abodeely ukázal, že mastné kyseliny i glukóza mohou být využity ve vnější dřeni králičí ledviny, ale že glukóza byla použita přednostně. Při podchlazení jsou metabolické potřeby ledvin mnohem nižší, ale dochází k měřitelné spotřebě glukózy, mastných kyselin a ketonů. Horsburgh ukázal, že lipid je využíván podchlazenými ledvinami, přičemž spotřeba palmitátu byla 0-15% normálu v krysí ledvinové kůře při 15 ° C. Pettersson ukázal, že na molárním základě byly glukóza a mastné kyseliny metabolizovány hypotermicky perfundovanými ledvinami přibližně stejnou rychlostí. Kůra podchlazené psí ledviny ukázala, že Huang ztrácel lipid (35% ztráta celkového lipidu po 24 hodinách), pokud nebyl do ledvinového perfuzátu přidán oleát. Huang poznamenal, že tato ztráta může ovlivnit strukturu buňky a že ztráta také naznačuje, že ledviny využívají mastné kyseliny. V pozdější publikaci Huang ukázal, že plátky kůry ledvin u psa metabolizovaly při 10 ° C mastné kyseliny, ale ne glukózu.

I když jsou poskytnuty správné živiny, mohou být ztraceny absorpcí do hadiček konzervačního systému. Lee prokázal, že silikonový kaučuk (materiál, který se hojně používá v systémech na ochranu ledvin) absorboval po 4 hodinách promývání 46% kyseliny olejové perfuzátu.

Akumulace toxinů

Abouna ukázal, že amoniak se uvolňoval do perfuzátu během 3denního skladování ledvin, a navrhl, že by to mohlo být toxické pro buňky ledvin, pokud by nebylo odstraněno častým nahrazováním perfuzátu. Nějakou podporu pro použití výměny perfuzátu během dlouhých perfúzí poskytl Liu, který použil výměnu perfuzátu ve svých úspěšných 7denních skladovacích experimentech. Grundmann také zjistil, že 96hodinová kvalita konzervace byla zlepšena použitím dvojnásobného objemu perfuzátu nebo výměnou perfuzátu. Grundmannovy závěry však byly založeny na srovnání s kontrolní skupinou pouze 3 psů. Cohen nebyl schopen prokázat žádnou produkci amoniaku během 8 dnů perfúze a žádný užitek z výměny perfuzátu; ukázalo se, že progresivní alkalita, ke které došlo během perfúze, byla způsobena tvorbou hydrogenuhličitanu.

Toxické poškození z perfuzátu

Ukázalo se, že některé perfuzáty mají toxické účinky na ledviny v důsledku neúmyslného zahrnutí určitých chemických látek do jejich složení. Collins ukázal, že prokain obsažený ve formulaci jeho proplachovacích tekutin může být toxický, a Pegg uvedl, jak mohou být toxické materiály, jako jsou plastifikátory PVC, vymyty z hadiček perfuzního okruhu. Dvořák ukázal, že přidání methyl-prednisolonu k perfuzátu, o kterém si Woods myslel, že je zásadní, může být za určitých okolností škodlivé. Ukázal, že s více než g methyl-prednisolonu v 650 ml perfuzátu (ve srovnání s 250 mg v 1 litru použitém Woodsem) došlo po 20 hodinách perfuze k nevratným hemodynamickým a strukturálním změnám v ledvinách. Došlo k nekróze kapilárních smyček, okluzi Bowmanových prostorů, zesílení bazální membrány a poškození endoteliálních buněk.

Vymytí základních substrátů

Warnick považoval hladinu nukleotidů zbývajících v buňce po skladování za důležitou při určování, zda bude buňka schopna znovu syntetizovat ATP a zotavit se po opětovném zahřátí. Častá změna perfuzátu nebo použití velkého objemu perfuzátu má teoretickou nevýhodu v tom, že rozložené adeninové nukleotidy mohou být vymyty z buněk, a proto nejsou k dispozici pro opětovnou syntézu na ATP, když se ledvina ohřívá.

Zranění jaderné DNA

Jaderná DNA je zraněna během chladného skladování ledvin. Lazarus ukázal, že k zlomení jednořetězcové DNA došlo do 16 hodin v hypotermicky uložených ledvinách myší, přičemž poranění bylo trochu potlačeno skladováním v Collinsových nebo Sackových řešeních. Toto jaderné poranění se lišilo od poranění teplého, když došlo k zlomům dvouvláknových DNA.

Mechanické poranění cévního systému

Metody skladování perfuze mohou mechanicky poškodit vaskulární endotel ledviny, což vede k arteriální trombóze nebo depozici fibrinu po reimplantaci. Hill poznamenal, že v lidských ledvinách koreluje ukládání fibrinu v glomerulu po reimplantaci a pooperační funkci s délkou perfuze. Vzal biopsie při revaskularizaci z lidských ledvin konzervovaných perfuzí nebo uchováváním ledu a pomocí elektronové mikroskopie ukázal, že k narušení endotelu došlo pouze u těch ledvin, které byly perfundovány. Biopsie odebrané jednu hodinu po revaskularizaci prokázaly adhezi krevních destiček a fibrinu k jakékoli oblasti obnažené vaskulární bazální membrány. Jiný typ vaskulárního poškození popsal Sheil, který ukázal, jak může být trysková léze vytvořena distálně od kanyly vázané do renální tepny, což vede k arteriální trombóze přibližně 1 cm od místa kanyly.

Postimplantační poranění

Existují důkazy, že imunologické mechanismy mohou po reimplantaci poškodit hypotermicky perfundované ledviny, pokud perfuzát obsahuje specifickou protilátku. Cross popsal dva páry ledvin lidské mrtvoly, které byly perfundovány současně s kryoprecipitovanou plazmou obsahující typově specifickou HLA protilátku k jednomu z párů. Obě tyto ledviny utrpěly časnou arteriální trombózu. Light popsal podobné hyperakutní odmítnutí po skladování perfuze a ukázal, že použitá kryoprecipitovaná plazma obsahovala cytotoxickou IgM protilátku. Toto potenciální nebezpečí použití kryoprecipitované plazmy experimentálně demonstroval Filo, který perfundoval psí ledviny po dobu 24 hodin specificky senzibilizovanou kryoprecipitovanou psí plazmou a zjistil, že může vyvolat glomerulární a vaskulární léze kapilárním překrvením, otokem endotelu, infiltrací polymorfonukleárními leukocyty a arteriální trombózou. Imunofluorescenční mikroskopie prokázala specifickou vazbu IgG na endoteliální povrchy, v glomerulech a také v cévách. Po reimplantaci došlo k fixaci komplementu a poškození tkáně podobným způsobem. Existovala určitá korelace mezi závažností histologického poškození a následnou funkcí ledvin.

Mnoho pracovníků se pokusilo zabránit reimplantaci ledvin během reimplantace, ale pouze Cohen popsal použití systému aktivního chlazení. Měření uvolňování lysozomálního enzymu z ledvin vystavených falešným anastomózám, ať už do nebo z chladicího systému, prokázaly, jak citlivé byly ledviny na opětovné zahřátí po určité době skladování v chladu, a potvrdily účinnost chladicího systému při prevenci uvolňování enzymu. Dalším faktorem při minimalizaci poranění při reimplantačních operacích může být to, že ledviny byly udržovány na 7 ° C v chladicí spirále, která byla v určité míře od teploty použité během skladování perfuze, takže ledviny nebyly vystaveny většímu změny teploty, ke kterým by došlo, kdyby bylo použito chlazení ledem.

Dempster popsal použití pomalého uvolňování cévních svorek na konci reimplantačních operací ledvin, aby nedošlo k poranění ledvin, ale jiní pracovníci nezmínili, zda tento manévr využili či nikoli. Poté, co Cohen zjistil vaskulární poranění s nitro renálním krvácením po 3 dnech skladování perfuze, byla pro všechny následující experimenty použita technika pomalé revaskularizace s cílem poskytnout nitro renálním cévám čas, aby dostatečně obnovily svůj tón, aby se zabránilo plnému systolickému tlaku aplikován na křehké glomerulární cévy. Absenci hrubého poškození cév v jeho pozdějších perfúzích lze přičíst použití tohoto manévru.

Reference