Polymorfismus délky restrikčního fragmentu - Restriction fragment length polymorphism
V molekulární biologii je polymorfismus délky restrikčních fragmentů ( RFLP ) technikou, která využívá variace v homologních sekvencích DNA , známých jako polymorfismy , za účelem rozlišení jedinců, populací nebo druhů nebo k určení umístění genů v sekvenci. Termín se může vztahovat na samotný polymorfismus, jak je detekován prostřednictvím různých umístění míst restrikčních enzymů , nebo na související laboratorní techniku, pomocí níž lze tyto rozdíly ilustrovat. Při analýze RFLP je vzorek DNA štěpen na fragmenty jedním nebo více restrikčními enzymy a výsledné restrikční fragmenty jsou poté separovány gelovou elektroforézou podle jejich velikosti.
I když je nyní z důvodu vzniku levných technologií sekvenování DNA do značné míry zastaralá , analýza RFLP byla první technikou profilování DNA, která byla dostatečně levná na to, aby viděla široké uplatnění. RFLP analýza byla důležitým raným nástrojem při mapování genomu , lokalizaci genů pro genetické poruchy , stanovení rizika onemocnění a testování otcovství .
RFLP analýza
Základní technika pro detekci RFLP zahrnuje fragmentaci vzorku DNA za použití restrikčního enzymu , který může selektivně štěpit molekulu DNA, kdykoli je v procesu známém jako restrikční štěpení rozpoznána krátká, specifická sekvence . Fragmenty DNA produkované štěpením se poté rozdělí na délku způsobem známým jako elektroforéza na agarózovém gelu a přenesou se na membránu postupem Southern blot . Hybridizace membrány na značenou sondu DNA pak určuje délku fragmentů, které jsou komplementární se sondou. Polymorfismus délky restrikčního fragmentu se říká, že nastává, když se délka detekovaného fragmentu mezi jednotlivci liší, což indikuje neidentické sekvenční homologie. Každá délka fragmentu je považována za alelu , ať už ve skutečnosti obsahuje kódující oblast nebo ne, a může být použita v následné genetické analýze.
Příklady
Existují dva společné mechanismy, kterými se velikost konkrétního restrikčního fragmentu může lišit. V prvním schématu je malý segment genomu detekován sondou DNA (silnější čára). V alele A je genom štěpen restrikčním enzymem na třech blízkých místech (trojúhelníky), ale sonda detekuje pouze fragment zcela vpravo. V alele a bylo restrikční místo 2 ztraceno mutací , takže sonda nyní detekuje větší fúzovaný fragment běžící z míst 1 až 3. Druhý diagram ukazuje, jak by tato variace velikosti fragmentu vypadala na Southern blotu a jak každá alela (dva na jednotlivce) mohou být zděděni u členů rodiny.
Ve třetím schématu jsou sonda a restrikční enzym vybrány pro detekci oblasti genomu, která obsahuje segment tandemového opakování s proměnným počtem (VNTR) (rámečky ve schematickém diagramu). V alele c je ve VNTR pět opakování a sonda detekuje delší fragment mezi dvěma restrikčními místy. V alele d jsou ve VNTR pouze dvě opakování, takže sonda detekuje kratší fragment mezi stejnými dvěma restrikčními místy. Polymorfismy mohou také vést k jiným genetickým procesům, jako jsou inzerce , delece , translokace a inverze . Testy RFLP vyžadují mnohem větší vzorky DNA než testy s krátkým tandemovým opakováním (STR).
Aplikace
Analýza variací RFLP v genomech byla dříve důležitým nástrojem při mapování genomu a analýze genetických chorob. Pokud by se vědci pokoušeli zpočátku určit chromozomální umístění konkrétního genu onemocnění, analyzovali by DNA členů rodiny postižené touto nemocí a hledali by alely RFLP, které vykazují podobný vzor dědičnosti jako u této choroby (viz. genetická vazba ). Jakmile byl lokalizován gen nemoci, RFLP analýza jiných rodin mohla odhalit, kdo je pro toto onemocnění ohrožen, nebo kdo pravděpodobně bude nositelem mutantních genů. Test RFLP se používá k identifikaci a diferenciaci organismů analýzou jedinečných vzorců v genomu. Používá se také při identifikaci rychlosti rekombinace v lokusech mezi restrikčními místy.
RFLP analýza byla také základem pro rané metody genetických otisků prstů , užitečné při identifikaci vzorků získaných z míst činu , při určování otcovství a při charakterizaci genetické rozmanitosti nebo šlechtitelských vzorců v populacích zvířat.
Alternativy
Technika pro analýzu RFLP je však pomalá a těžkopádná. Vyžaduje velké množství DNA vzorku a kombinovaný proces značení sondy, fragmentace DNA, elektroforéza, blotování, hybridizace, promývání a autoradiografie může trvat až měsíc. Omezená verze metody RFLP, která používala oligonukleotidové sondy, byla uvedena v roce 1985. Výsledky projektu Human Genome Project do značné míry nahradily potřebu mapování RFLP a identifikaci mnoha jednonukleotidových polymorfismů (SNP) v tomto projektu (a také jako přímá identifikace mnoha chorobných genů a mutací) nahradila potřebu analýzy vazeb na choroby RFLP (viz genotypizace SNP ). Analýza alel VNTR pokračuje, ale nyní se obvykle provádí metodami polymerázové řetězové reakce (PCR). Například standardní protokoly pro otisky prstů DNA zahrnují PCR analýzu panelů s více než tuctem VNTR.
RFLP se stále používá při výběru pomocí markeru. Polymorfismus délky koncových restrikčních fragmentů (TRFLP nebo někdy T-RFLP) je technika původně vyvinutá pro charakterizaci bakteriálních společenstev ve vzorcích smíšených druhů. Tato technika byla také aplikována na jiné skupiny, včetně půdních hub. TRFLP funguje pomocí PCR amplifikace DNA pomocí párů primerů, které byly značeny fluorescenčními značkami. Produkty PCR se poté štěpí pomocí enzymů RFLP a výsledné obrazce se vizualizují pomocí sekvenceru DNA. Výsledky jsou analyzovány buď jednoduchým spočítáním a porovnáním pásů nebo píků v profilu TRFLP, nebo porovnáním pásů z jednoho nebo více běhů TRFLP s databází známých druhů. Tato technika je v některých aspektech podobná teplotnímu gradientu nebo denaturační gradientové gelové elektroforéze (TGGE a DGGE).
Změny sekvence přímo spojené s RFLP lze také rychleji analyzovat pomocí PCR. Amplifikace může být směrována přes změněné restrikční místo a produkty jsou štěpeny restrikčním enzymem. Tato metoda se nazývá štěpená amplifikovaná polymorfní sekvence (CAPS). Alternativně může být amplifikovaný segment analyzován alelicky specifickými oligonukleotidovými sondami (ASO), což je proces, který lze často provést jednoduchým dot blot .
Viz také
Reference
- ^ Saiki, R .; Scharf, S; Faloona, F; Mullis, K .; Horn, G .; Erlich, H .; Arnheim, N (1985). „Enzymatická amplifikace beta-globinových genomových sekvencí a analýza restrikčních míst pro diagnostiku srpkovité anémie“. Věda . 230 (4732): 1350–1354. Bibcode : 1985Sci ... 230,1350S . doi : 10,1126/věda.2999980 . ISSN 0036-8075 . PMID 2999980 .