Barvení - Staining

Barvení je technika používaná ke zvýšení kontrastu ve vzorcích, obvykle na mikroskopické úrovni. Skvrny a barviva jsou často používány v histologii (mikroskopickém studiu biologických tkání) a v lékařských oborech histopatologie , hematologie a Cytopatologie , že zaměření na studium a diagnóz z onemocnění na mikroskopické úrovni. Barvy lze použít k definování biologických tkání (zvýraznění například svalových vláken nebo pojivové tkáně ), buněčných populací (klasifikace různých krevních buněk ) nebo organel v jednotlivých buňkách.

V biochemii zahrnuje přidání barviva specifického pro danou třídu ( DNA , proteiny , lipidy , uhlohydráty ) na substrát za účelem kvalifikace nebo kvantifikace přítomnosti konkrétní sloučeniny. K podobným účelům může sloužit barvení a fluorescenční značkování . Biologické barvení se také používá k označení buněk v průtokové cytometrii a k označení proteinů nebo nukleových kyselin při gelové elektroforéze . Světelné mikroskopy se používají k prohlížení obarvených vzorků při vysokém zvětšení, typicky s použitím světlého pole nebo epi-fluorescenčního osvětlení.

Barvení není omezeno na biologické materiály, lze jej také použít ke studiu struktury jiných materiálů, například lamelárních struktur semikrystalických polymerů nebo doménových struktur blokových kopolymerů .

In vivo vs In vitro

Barvení in vivo (také nazývané vitální barvení nebo intravitální barvení) je proces barvení živých tkání. Tím, že některé buňky nebo struktury nabývají kontrastních barev, lze jejich formu ( morfologii ) nebo polohu v buňce nebo tkáni snadno vidět a studovat. Obvyklým účelem je odhalit cytologické detaily, které by jinak nemusely být zřejmé; barvení však může také odhalit, kde v buňkách nebo tkáních probíhají určité chemikálie nebo specifické chemické reakce.

Barvení in vitro zahrnuje barvení buněk nebo struktur, které byly odstraněny z jejich biologického kontextu. Některé skvrny jsou často kombinovány, aby odhalily více detailů a funkcí, než jediná skvrna samotná. V kombinaci se specifickými protokoly pro fixaci a přípravu vzorků mohou vědci a lékaři používat tyto standardní techniky jako konzistentní, opakovatelné diagnostické nástroje. Counterstain se skvrny, které činí buňky nebo struktury viditelnější, když ne zcela viditelný hlavní skvrnu.

• Křišťálová fialka barví grampozitivní i gramnegativní organismy. Ošetření alkoholem odstraní krystalově fialovou barvu pouze z gramnegativních organismů. Safranin jako kontrastní barvivo se používá k barvení gramnegativních organismů, které byly odbarveny alkoholem.

Zatímco ex vivo mnoho buněk nadále žije a metabolizuje, dokud nejsou „fixovány“. Některé metody barvení jsou založeny na této vlastnosti. Tato barviva vyloučená živými buňkami, ale zachycená již mrtvými buňkami, se nazývají vitální skvrny (např. Trypanová modř nebo propidiumjodid pro eukaryotické buňky). Ty, které vstupují a obarvují živé buňky, se nazývají supravitální skvrny (např. Nová methylenová modř a brilantní kresylová modř pro barvení retikulocytů ). Tyto skvrny jsou však pro organismus nakonec toxické, některé více než jiné. Částečně kvůli jejich toxické interakci uvnitř živé buňky, když supravitální skvrny vstupují do živé buňky, mohou produkovat charakteristický vzor barvení odlišný od barvení již fixované buňky (např. Vzhled „retikulocytů“ versus difúzní „polychromasie“). K dosažení požadovaných účinků se skvrny používají ve velmi zředěných roztocích v rozmezí od 1 : 5 000 do 1 : 500 000 (Howey, 2000). Všimněte si, že mnoho skvrn může být použito v živých i fixovaných buňkách.

Příprava

Zahrnuté přípravné kroky závisí na typu plánované analýzy; mohou být vyžadovány některé nebo všechny následující postupy.

Mokré držáky- mokré držáky se používají k prohlížení živých organismů a lze je vyrobit pomocí vody a určitých skvrn. Kapalina se přidá na podložní sklíčko před přidáním organismu a na vzorek se umístí krycí sklíčko do vody a skvrny, aby se pomohlo zadržet v zorném poli .

Fixace - která může sama o sobě sestávat z několika kroků - má za cíl co nejvíce zachovat tvar příslušných buněk nebo tkání. Někdy se tepelná fixace používá k usmrcení, ulpívání a úpravě vzorku tak, aby přijímal skvrny. Většina chemických fixátorů (chemikálie způsobující fixaci) vytváří chemické vazby mezi proteiny a jinými látkami ve vzorku, čímž se zvyšuje jejich tuhost. Mezi běžné fixační prostředky patří formaldehyd , ethanol , methanol a/nebo kyselina pikrová . Kousky tkáně mohou být vloženy do parafínového vosku, aby se zvýšila jejich mechanická pevnost a stabilita a usnadnilo se krájení na tenké plátky.

Mořidlo: Jedná se o chemická činidla, která mají schopnost vytvářet barviva k barvení materiálů, které jsou jinak nestabilní

Mořidla jsou rozdělena do dvou kategorií:

a) Základní mořidlo: Reaguje s kyselými barvivy, např. kamencem, síranem železnatým, cetylpyridiniumchloridem atd.

b) Kyselé mořidlo: Reagujte s bazickými barvivy, např. kyselinou pikrovou, kyselinou tříslovou atd.

Přímé barvení: Provádí se bez mořidla.

Nepřímé barvení: Barvení způsobené mořidlem.

Tabulka představuje techniky nepřímého barvení a mořidla použitá v každé z nich:

Sr č.	Název techniky nepřímého barvení	Použité jméno mořidla
1.)	Gramovo barvení	Gramův jód
2.)	Barvení buněčné stěny a.) Ringerova metoda b.) Dyarova metoda	10% kyselina tříslová 0,34% CPC
3.)	Flagella barvení a.) Leifsonova metoda b.) Loefflerova metoda	Kyselina tříslová v Leifsonově skvrně Loefflerovo mořidlo (20%kyselina tříslová)
4.)	Spirochetové barvení a.) Fontanova metoda b.) Beckerova metoda	Moridlo Fontana (5%kyselina tříslová) Moridlo Fontana (5%kyselina tříslová)

Permeabilizace zahrnuje ošetření buněk (obvykle) mírným surfaktantem . Toto ošetření rozpouští buněčné membrány a umožňuje větší molekuly barviva do vnitřku buňky.

Upevnění obvykle zahrnuje připojení vzorků na sklíčko mikroskopu pro pozorování a analýzu. V některých případech mohou být buňky pěstovány přímo na sklíčku. U vzorků volných buněk (jako u krevního nátěru nebo papírového nátěru ) lze vzorek aplikovat přímo na podložní sklíčko. U větších kusů tkáně se pomocí mikrotomu vytvoří tenké řezy (plátky); tyto řezy lze poté namontovat a zkontrolovat.

Standardizace

Většina barviv běžně používaných v mikroskopii je k dispozici jako barviva certifikovaná BSC . To znamená, že vzorky šarže výrobce byly testovány nezávislým orgánem, komisí pro biologické barvení ( BSC ), a shledaly, že splňují nebo překračují určité standardy čistoty, obsahu barviv a účinnosti při barvicích technikách, což zajišťuje přesnější provedení experimentů a spolehlivost Výsledek. Tyto standardy jsou publikovány v časopise Komise Biotechnic & Histochemistry . Mnoho barviv je v rozporu od jednoho dodavatele k druhému. Použití skvrn certifikovaných BSC eliminuje zdroj neočekávaných výsledků.

Někteří prodejci prodávají skvrny „certifikované“ sami spíše než Komisí pro biologické skvrny. Takové produkty mohou, ale nemusí být vhodné pro diagnostické a jiné aplikace.

Negativní barvení

Jednoduchá metoda barvení bakterií, která je obvykle úspěšná, i když metody pozitivního barvení selžou, je použít negativní barvení . Toho lze dosáhnout namazáním vzorku na podložní sklíčko a následným nanesením nigrosinu (černé syntetické barvivo) nebo indického inkoustu (vodná suspenze částic uhlíku). Po vysušení mohou být mikroorganismy viděny v mikroskopii v jasném poli jako lehčí inkluze dobře kontrastní proti tmavému prostředí, které je obklopuje. Negativní barvení je schopno obarvit pozadí místo organismů, protože buněčná stěna mikroorganismů má typicky negativní náboj, který odpuzuje negativně nabité barvivo. Barviva použitá při negativním barvení jsou kyselá. Poznámka: negativní barvení je mírná technika, která nemusí zničit mikroorganismy, a proto není vhodná pro studium patogenů.

Pozitivní barvení

Na rozdíl od negativního barvení používá pozitivní barvení základní barviva k barvení vzorku na světlém pozadí. Zatímco chromofor se používá pro negativní i pozitivní barvení, typ chromoforu použitý v této technice je kladně nabitý ion místo záporného. Negativně nabitá buněčná stěna mnoha mikroorganismů přitahuje kladně nabitý chromofor, který způsobí, že vzorek absorbuje skvrnu a dává jí barvu použitého barviva. Pozitivní barvení se v mikrobiologii používá častěji než negativní barvení. Různé typy pozitivního barvení jsou uvedeny níže.

Jednoduché barvení versus diferenciální barvení

Jednoduché barvení je technika, která současně používá pouze jeden typ skvrn na podložním sklíčku. Protože se používá pouze jedna skvrna, vzorky (pro pozitivní skvrny) nebo pozadí (pro negativní skvrny) budou jednobarevné. Jednoduché skvrny se proto obvykle používají k prohlížení pouze jednoho organismu na sklíčko. Diferenciální barvení používá více skvrn na jedno sklíčko. Na základě použitých skvrn budou mít organismy s různými vlastnostmi různé barvy, což umožní kategorizaci více vzorků. Diferenciální barvení lze také použít k barvení různých organel v rámci jednoho organismu, což lze pozorovat při barvení endospory .

Druhy barvicích technik

Sr. č.	Technika barvení	Příprava	aplikace	Výsledek
1.	Jednoduché (černobílé)	Potřete skvrnu jediným barvivem. např. Methylenová modř, safranin atd	Používá se ke zvýraznění mikrobů a ilustraci buněk tvary a aranžmá.	Organismy jsou obarveny barvou nanesené skvrny
2.	Negativní (Reliéf)	Rozmíchejte s Nigrosinem a namažte do tenkého filmu	Studujte morfologii buněk	Organismus je obarvený, pozadí je černé
3	Gram	Primární barvení: Krystalová fialová nanesená na film, poté ošetřená jódem (mořidlem), alkoholem (odbarvovačem) a zbarvená safraninem	Charakterizuje bakterie v jedné ze dvou skupin, grampozitivní nebo gramnegativní	Grampozitivní má purpurovou barvu Gramově negativní vypadá růžově
4	Rychle kyselé (technika Ziehl-Neelsen)	Film barvený horkým odbarveným ZNCF (kyselý alkohol) a kontrastní barvení methylenovou modří	Oddělte neodbarvené kyselé rychlé bakterie, které nejsou odbarveny, od obarvených nekyselých rychlých bakterií	Kyselina rychlé bakterie: červená Nekyselý rychlý: modrý
5	Endospore (Dornorova metoda)	Primární skvrna Malachitové zelené teplo fixované k proniknutí do spor; vegetativní buňky jsou barveny safraninem	Detekuje přítomnost endospor v šesti rodech bakterií	Endospory: Zelená Vegetativní buňky: červená
6	Kapsle A: Hissova metoda (pozitivní technika) B: Manevalsova technika (negativní)	Po ošetření síranem měďnatým namažte skvrnu barvením Hiss Bakteriální suspenze potřená kongovou červení a nanesena Manevalova skvrna	Kapsle lze pozorovat jako čiré zóny obklopující buňky kapsulárních bakterií a slouží k prokázání přítomnosti kapslí.	Kapsle: Světle fialová/ světle fialová barva Bakterie: Fialová kapsle, bakteriální buňka, stojí na tmavém pozadí
7	Buněčná stěna (Dyarova metoda)	Nátěr ošetřený CPC, který disociuje za vzniku kladně nabitého cetylpyridinia a záporně nabitých chloridových iontů. Kladně nabité ionty jsou adsorbovány na záporně nabitou buněčnou stěnu	Barví buněčnou stěnu bakterií	Buněčná stěna: Červená Cytoplazma: Modrá
8	Flagella (Leifsonova metoda)	Mořidlo před barvením zesiluje bičíky a mikroskopicky zvyšuje viditelnost při obarvení Leifsonovým barvivem	Ukazuje přítomnost bičíků	Flagella: Červená Vegetativní buňky: Modrá
9	Jaderný materiál (Feulgenova technika)	Nátěr je zpracován na hydrolýzu, aby se uvolnily puriny z DNA, puriny způsobí posun formy furanózy na aldehyd. Aldehydové skupiny jsou k dispozici pro reakci se Schiffovým činidlem za vzniku adičních sloučenin.	Prokázat přítomnost DNA v buňce. Ale pro detekci DNA by měla být RNA selektivně zničena kyselou hydrolýzou bez ovlivnění DNA	Jaderný materiál- narůžověle fialová, Cytoplazma- bezbarvá
10	Metachromatické granule (Albertsova metoda)	Nátěr se nejprve ošetří chloroformem, aby se odstranily tuky. Nátěr nanesený Albertsovým barvivem, které obsahuje kationtová barviva, jako je toluidinová modř a malachitová zeleň. Toluidinová modř přednostně barví granule, zatímco malachitová zeleň barví cytoplazmu.	Granule vykazují typickou monochromatickou povahu, která se používá k demonstraci granulí	Granule: namodralá černá, cytoplazma: zelená
11	Intracelulární lipidy (Burdonova metoda)	Lipidy jsou obarveny barvivy rozpustnými v tucích, jako je súdánská černá. Při aplikaci sudanských černých-B barviv se přesunou do lipidů a zůstanou tam, zatímco cytoplazma je zbarvena safraninem.	Detekovat přítomnost lipidů v buněčné stěně, buněčné membráně nebo tukových globulích (PHB v cytoplazmě)	Lipidové granule: tmavě modrá, Cytoplazma: Světle růžová
12	Polysacharid (metoda Hotch Kuss)	Polysacharid je oxidován jodistanem za vzniku polyaldehydu, který reaguje se Schiffovými činidly na červenou barvu, zatímco cytoplazma je barvena malachitově zeleně	Detekuje akumulaci polysacharidových granulí v buňkách	Polysacharid: červený Cytoplazma: Zelená

Specifické techniky

Gramovo barvení

Gramové barvení se používá ke stanovení gramového stavu ke klasifikaci bakterií široce na základě složení jejich buněčné stěny . Gramovo barvení používá krystalovou fialku k barvení buněčných stěn, jódu (jako mořidlo) a fuchsinu nebo safraninu v kontrastním barvení (k označení všech bakterií). Gram status, pomáhá rozdělit vzorky bakterií do dvou skupin, obecně reprezentujících jejich základní fylogenezi. Tato vlastnost v kombinaci s jinými technikami z něj činí užitečný nástroj v klinických mikrobiologických laboratořích, kde může být důležitá při včasném výběru vhodných antibiotik .

Na většině přípravků obarvených gramem se gramnegativní organismy zdají červené nebo růžové kvůli svému kontrastnímu barvení . V důsledku přítomnosti vyššího obsahu lipidů se po ošetření alkoholem poréznost buněčné stěny zvyšuje, a proto může projít komplex CVI (krystalová fialová-jód). Primární skvrna tedy není zachována. Navíc na rozdíl od většiny grampozitivních bakterií mají gramnegativní bakterie pouze několik vrstev peptidoglykanu a sekundární buněčnou membránu vyrobenou převážně z lipopolysacharidu.

Barvení endospory

Barvení endospory se používá k identifikaci přítomnosti nebo nepřítomnosti endospor , které velmi obtížně zabíjejí bakterie. Bakteriální spory se ukázaly jako obtížně barvitelné, protože nejsou propustné pro vodná barvicí činidla. Barvení endospory je zvláště užitečné pro identifikaci bakteriálních patogenů tvořících endospory , jako je Clostridium difficile . Před vývojem efektivnějších metod bylo toto barvení provedeno Wirtzovou metodou s tepelnou fixací a kontrastním barvením. Díky použití malachitové zeleně a zředěného poměru karbol fuchsinu byla fixace bakterií v kyselině osmové skvělým způsobem, jak zajistit, aby nedocházelo k míchání barviv. Nově revidované metody barvení však výrazně zkrátily dobu potřebnou k vytvoření těchto skvrn. Tato revize zahrnovala substituci karbol fuchsinu vodným safraninem spárovaným s nově zředěným 5% vzorcem malachitové zeleně. Toto nové a vylepšené složení skvrn bylo provedeno stejným způsobem jako dříve s použitím tepelné fixace, opláchnutí a suchého blotování pro pozdější vyšetření. Po vyšetření budou všechny bakterie tvořící endospory obarveny zeleně a všechny ostatní buňky budou vypadat červeně.

Ziehl-Neelsen skvrna

Ziehl-Neelsenovo skvrna je skvrna acidorezistentní použito pro barvení druhů Mycobacterium tuberculosis , které nejsou skvrna se standardní laboratorní postupy barvení, jako jsou Gram barvením.

Toto barvení se provádí použitím jak červeně zbarveného karbol fuchsinu, který barví bakterie, tak proti skvrnám, jako je methylenová modř .

Barvení hematoxylinem a eosinem (H&E)

Barvení hematoxylinem a eosinem se často používá v histologii ke zkoumání tenkých řezů tkáně. Haematoxylin barví jádra buněk modře, zatímco eosin barví cytoplazmu, pojivovou tkáň a další extracelulární látky růžově nebo červeně. Eosin je silně absorbován červenými krvinkami a zbarvuje je jasně červeně. V obratně vyrobeném přípravku H&E jsou červené krvinky téměř oranžové a kolagen a cytoplazma (zejména svaly) získávají různé odstíny růžové.

Papanicolaouovo barvení

Barvení Papanicolaou nebo barvení PAP bylo vyvinuto jako náhrada za cytologii aspirace s jemnou jehlou (FNAC) v naději, že se zkrátí doby barvení a sníží náklady, aniž by byla ohrožena kvalita. Toto barvení je často používanou metodou pro zkoumání vzorků buněk z různých typů tkání v různých orgánech. Barvení PAP prošlo několika úpravami, aby se stalo „vhodnou alternativou“ pro FNAC. Tento přechod pramenil z ocenění mokrých fixních nátěrů vědci, kteří zachovali struktury jader na rozdíl od neprůhledného vzhledu vzduchem vysušených Romanowských nátěrů. To vedlo k vytvoření hybridního barvení za mokra fixovaného a sušeného na vzduchu známého jako ultrarychlé barvení papanicolaou. Tato modifikace zahrnuje použití nosního fyziologického roztoku k rehydrataci buněk za účelem zvýšení transparentnosti buněk a je spárována s použitím alkoholického formalinu ke zvýraznění barev jader. Papanicolaouovo barvení se nyní používá místo cytologického barvení u všech typů orgánů kvůli jeho zvýšení morfologické kvality, zkrácení doby barvení a snížení nákladů. Často se používá k barvení vzorků Pap stěru . Využívá kombinace hematoxylinem , Orange G , eosin Y , světle zelený SF nažloutlý , a někdy Bismarck Brown Y .

Barvení PAS

Periodic acid-Schiff je histologické speciální barvivo používané k označení sacharidů ( glykogen , glykoprotein , proteoglykany ). PAS se běžně používá v jaterní tkáni, kde se vytvářejí glykogenové depozity, což se provádí ve snaze odlišit různé typy chorob ukládajících glykogen. PAS je důležitý, protože dokáže detekovat glykogenové granule, které se nacházejí v nádorech vaječníků a slinivky břišní endokrinního systému, jakož i v močovém měchýři a ledvinách renálního systému. Suterénní membrány se mohou také objevit ve skvrně PAS a mohou být důležité při diagnostice onemocnění ledvin. Vzhledem k vysokému objemu uhlohydrátů v buněčné stěně hyf a kvasinkových forem hub může barvení kyselinou jodistou -Schiff pomoci lokalizovat tyto druhy ve tkáňových vzorcích lidského těla.

Massonův trichrom

Massonův trichrom je (jak název napovídá) protokolem tříbarevného barvení. Receptura se vyvinula z původní Massonovy techniky pro různé specifické aplikace, ale všechny jsou vhodné pro rozlišení buněk od okolní pojivové tkáně . Většina receptů produkuje červený keratin a svalová vlákna, modré nebo zelené barvení kolagenu a kostí , světle červené nebo růžové barvení cytoplazmy a jádra černých buněk .

Romanowského skvrny

Tyto Romanowského skvrny je považován za polychromovaný barvení účinek a je založena na kombinaci eosinem plus (chemicky sníženého eosinem ) a demethylovaného methylenovou modří (obsahující jeho oxidačních produktů azur A a azurové B ). Toto barvení vyvíjí různé barvy pro všechny buněčné struktury („Romanowsky-Giemsův efekt), a proto bylo použito k barvení polymorfů neutrofilů a buněčných jader. Mezi běžné varianty patří Wrightova skvrna , Jennerova skvrna , May-Grunwaldova skvrna, Leishmanova skvrna a Giemsova skvrna .

Všechny se používají k vyšetření vzorků krve nebo kostní dřeně . Při kontrole krevních buněk jsou upřednostňovány před H&E, protože různé typy leukocytů (bílých krvinek) lze snadno rozlišit. Všechny jsou také vhodné pro vyšetření krve k detekci krevních parazitů, jako je malárie .

Barvení stříbrem

Barvení stříbrem je použití stříbra k barvení histologických řezů . Tento druh barvení je důležitý při demonstraci proteinů (například kolagenu typu III ) a DNA . Používá se k zobrazení látek uvnitř i vně buněk . Barvení stříbrem se také používá v gelové elektroforéze s teplotním gradientem .

Buňky Argentaffin redukují po fixaci formalinu roztok stříbra na kovové stříbro . Tuto metodu objevil italský Camillo Golgi pomocí reakce mezi dusičnanem stříbrným a dvojchromanem draselným , čímž se v některých buňkách vysrážel chroman stříbrný (viz Golgiho metoda ). A rgyrophilic buňky snížit stříbrného na kovové stříbro poté, co byl vystaven skvrnu, která obsahuje redukční činidlo . Příkladem toho může být hydrochinon nebo formalin.

Barvení Súdánu

Barvení Súdánu využívá sudanská barviva k barvení sudanofilních látek, často včetně lipidů . Často se používá Sudan III , Sudan IV , Oil Red O , Osmium tetroxide a Sudan Black B. Barvení Súdánu se často používá ke stanovení hladiny fekálního tuku při diagnostice steatorrhea .

Wirtz-Conklinovo barvení

Barvení Wirtz-Conklin je speciální technikou určenou k barvení skutečných endospor s použitím malachitového zeleného barviva jako primárního barviva a safraninu jako kontrastního barviva. Jakmile jsou obarveny, neodbarvují se. Přidávání tepla během procesu barvení je velkým faktorem, který k tomu přispívá. Teplo pomáhá otevřít membránu spor, aby barvivo mohlo vstoupit. Hlavním účelem této skvrny je ukázat klíčení bakteriálních spor. Pokud probíhá proces klíčení, pak spóra díky malachitové zeleni zbarví zeleně a okolní buňka bude od safraninu červená. Toto barvení může také pomoci určit orientaci spory v bakteriální buňce; ať už je to terminál (na špičce), subterminál (v buňce) nebo centrální (zcela uprostřed buňky).

Barvení peptidů hybridizujícím s kolagenem

Barvení peptidem hybridizujícím kolagenový peptid (CHP) umožňuje snadný a přímý způsob barvení denaturovaných kolagenů jakéhokoli typu (typ I, II, IV atd.) Bez ohledu na to, zda byly poškozeny nebo degradovány enzymatickými, mechanickými, chemickými nebo tepelnými prostředky. Fungují tak, že se znovu skládají do kolagenové trojšroubovice s dostupnými jednotlivými vlákny ve tkáni. Kogenerační jednotky mohou být vizualizovány jednoduchým fluorescenčním mikroskopem .

Běžné biologické skvrny

Různá barviva reagují nebo se koncentrují v různých částech buňky nebo tkáně a těchto vlastností se s výhodou využívá k odhalení konkrétních částí nebo oblastí. Některá z nejběžnějších biologických skvrn jsou uvedena níže. Pokud není uvedeno jinak, všechna tato barviva lze použít s fixovanými buňkami a tkáněmi; jsou zaznamenána vitální barviva (vhodná pro použití s ​​živými organismy).

Akridinový pomeranč

Akridinový pomeranč (AO) je fluorescenční kationtové barvivo selektivní pro nukleové kyseliny užitečné pro stanovení buněčného cyklu. Je propustný pro buňky a interaguje s DNA a RNA interkalací nebo elektrostatickými přitažlivostmi. Když je navázán na DNA, je spektrálně velmi podobný fluoresceinu. Stejně jako fluorescein je také užitečné jako nespecifické barvivo pro podsvícení konvenčně barvených buněk na povrchu pevného vzorku tkáně (fluorescenční podsvícení).

Bismarck hnědý

Bismarckova hnědá (také Bismarckova hnědá Y nebo Manchester hnědá) dodává žlutou barvu kyselým mucinům . a intenzivní hnědou barvu žírných buněk. Výchozí hodnotou této skvrny je, že odstraní jakoukoli jinou strukturu, která ji obklopuje, a sníží kvalitu kontrastu. Aby bylo užitečné, musí být spárováno s jinými skvrnami. Některá doplňující barviva použitá vedle Bismark hnědé jsou hematoxylin a toluidinová modř, které poskytují lepší kontrast v histologickém vzorku.

Karmín

Carmine je intenzivně červené barvivo používané k barvení glykogenu , zatímco karmínový kamenec je jaderné barvivo. Karmínové skvrny vyžadují použití mořidla, obvykle hliníku .

Coomassie modrá

Coomassie blue (také brilantní modrá) nespecificky barví proteiny silnou modrou barvou. Často se používá v gelové elektroforéze.

Kresylová fialová

Kresylová viola barví kyselé složky neuronální cytoplazmy na fialové, konkrétně na nissl těla. Často se používá při výzkumu mozku.

Křišťálově fialová

Křišťálově fialová , v kombinaci s vhodným mořidlem, barví buněčné stěny purpurově. Křišťálově fialová je skvrna používaná při Gramově barvení.

DAPI

DAPI je fluorescenční nukleární barvivo, excitované ultrafialovým světlem a po navázání na DNA vykazuje silnou modrou fluorescenci . DAPI se váže s A = T bohatými opakováními chromozomů. DAPI také není viditelný pomocí běžné transmisní mikroskopie. Může být použit v živých nebo pevných buňkách. Buňky obarvené DAPI jsou zvláště vhodné pro počítání buněk.

Eosin

Eosin se nejčastěji používá jako kontrastní látka k hematoxylinu, která dodává růžovou nebo červenou barvu cytoplazmatickému materiálu, buněčným membránám a některým extracelulárním strukturám. Také dodává červeným krvinkám výraznou červenou barvu . Eosin může být také použit jako kontrastní látka v některých variantách Gramova barvení a v mnoha dalších protokolech. Ve skutečnosti existují dvě velmi blízce příbuzné sloučeniny běžně označované jako eosin. Nejčastěji se používá eosin Y (také známý jako eosin Y ws nebo eosin nažloutlý); má velmi mírně nažloutlý nádech. Další eosinovou sloučeninou je eosin B (eosin namodralý nebo imperiální červený); má velmi slabé namodralé obsazení. Tato dvě barviva jsou zaměnitelná a použití jednoho nebo druhého je spíše záležitostí preference a tradice.

Ethidiumbromid

Ethidiumbromid interkaluje a barví DNA a vytváří fluorescenční červenooranžové barvení. Přestože neznečistí zdravé buňky, lze jej použít k identifikaci buněk, které jsou v závěrečných fázích apoptózy - takové buňky mají mnohem propustnější membrány . V důsledku toho je ethidiumbromid často používán jako marker apoptózy v buněčných populacích a k lokalizaci pásů DNA v gelové elektroforéze . Barvu lze také použít ve spojení s akridinovou oranžovou (AO) při počítání životaschopných buněk. Toto kombinované barvení EB/AO způsobuje, že živé buňky fluoreskují zeleně, zatímco apoptotické buňky si zachovávají výraznou červenooranžovou fluorescenci.

Kyselý fuchsin

Kyselý fuchsin lze použít k barvení kolagenu, hladkého svalstva nebo mitochondrií . Kyselý fuchsin se používá jako nukleární a cytoplazmatické barvivo v Malloryho trichromové metodě. Kyselý fuchsin barví cytoplazmu v některých variantách Massonova trichromu. Ve Van Giesonově mikro-fuchsinu dodává kyselý fuchsin svoji červenou barvu kolagenovým vláknům. Kyselý fuchsin je také tradiční barvivo pro mitochondrie (Altmannova metoda).

Hematoxylin

Haematoxylin (hematoxylin v Severní Americe) je jaderné barvivo. Používá se s mořidlem, hematoxylinová barviva jádra modrofialová nebo hnědá. Nejčastěji se používá s eosinem při barvení H&E (hematoxylin a eosin), což je jeden z nejběžnějších postupů v histologii .

Hoechstovy skvrny

Hoechst je bis -benzimidazol sloučenina derivát, který se váže na malém žlábku z DNA . Hoechstova barviva, často používaná ve fluorescenční mikroskopii pro barvení DNA, se po rozpuštění ve vodných roztocích jeví jako žlutá a při excitaci ultrafialovým zářením vyzařují modré světlo. Existují dva hlavní typy Hoechst : Hoechst 33258 a Hoechst 33342 . Tyto dvě sloučeniny jsou funkčně podobné, ale s malým rozdílem ve struktuře. Hoechst 33258 obsahuje koncovou hydroxylovou skupinu, a je tedy rozpustnější ve vodném roztoku, tato vlastnost však snižuje jeho schopnost proniknout do plazmatické membrány . Hoechst 33342 obsahuje ethylovou substituci na koncové hydroxylové skupině (tj. Ethyletherové skupině), díky čemuž je hydrofobnější pro snadnější průchod plazmatickou membránou

Jód

Jód se v chemii používá jako indikátor škrobu . Smícháním škrobu s jódem v roztoku vznikne intenzivně tmavě modrá barva, která představuje komplex škrob/jód. Škrob je látka společná většině rostlinných buněk, a proto slabý roztok jodu zabarví škrob přítomný v buňkách. Jód je jednou ze složek barvicí techniky známé jako Gramovo barvení , která se používá v mikrobiologii . Používá se jako mořidlo při Gramově barvení, jód zlepšuje vstup barviva přes póry přítomné v buněčné stěně/membráně.

Lugolov roztok nebo Lugolov jod (IKI) je hnědý roztok, který v přítomnosti škrobů zčernal a lze jej použít jako barvení buněk, čímž jsou jádra buněk viditelnější.

Při použití s ​​běžným octem (kyselinou octovou) se Lugolův roztok používá k identifikaci předrakovinových a rakovinných změn v cervikálních a vaginálních tkáních během následných vyšetření „Pap smear“ v rámci přípravy na biopsii. Kyselina octová způsobí, že abnormální buňky vyblednou, zatímco normální tkáně barví mahagonově hnědé z jódu.

Malachitová zeleň

Malachitová zeleň (také známá jako diamantová zelená B nebo viktoriánská zelená B) může být použita jako modrozelené kontrastní barvivo k safraninu v Gimenezově barvicí technice pro bakterie. Lze jej také použít k přímému barvení spór .

Methylová zeleň

Methylová zeleň se běžně používá u světlých polí a fluorescenčních mikroskopů k barvení chromatinu buněk tak, aby byly snadněji viditelné.

Methylenová modř

Methylenová modř se používá k barvení zvířecích buněk, jako jsou lidské lícní buňky, aby byla jejich jádra lépe pozorovatelná. Používá se také k barvení krevních filmů v cytologii.

Neutrální červená

Neutrální červená (nebo toluylenová červená) barví látku Nissl červeně. Obvykle se používá jako kontrastní látka v kombinaci s jinými barvivy.

Nilská modř

Nilská modř (nebo Nilská modř A) barví jádra na modro. Může být použit s živými buňkami.

Nilská červená

Nilská červená (také známá jako nilská modř oxazon) vzniká vařením nilské modři s kyselinou sírovou . Výsledkem je kombinace nilské červené a nilské modré. Nilská červeň je lipofilní skvrna; bude se hromadit v lipidových kuličkách uvnitř buněk a barvit je červeně. Nilskou červeň lze použít se živými buňkami. Při rozdělení na lipidy silně fluoreskuje, ale ve vodném roztoku prakticky vůbec.

Oxid osmitý (formální název: oxid osmičelý)

Oxid titaničitý se používá v optické mikroskopii k barvení lipidů . Rozpouští se v tucích a je organickými materiály redukován na elementární osmium, snadno viditelnou černou látku.

Propidium jodid

Propidiumjodid je fluorescenční interkalační činidlo, které lze použít k barvení buněk. Propidiumjodid se používá jako barvení DNA v průtokové cytometrii k vyhodnocení životaschopnosti buněk nebo obsahu DNA při analýze buněčného cyklu nebo v mikroskopii k vizualizaci jádra a dalších organel obsahujících DNA. Propidiumjodid nemůže procházet membránou živých buněk, což je užitečné k rozlišení nekrotických, apoptotických a zdravých buněk. PI se také váže na RNA, což vyžaduje ošetření nukleázami k rozlišení mezi barvením RNA a DNA

Rhodamin

Rhodamin je proteinově specifické fluorescenční barvivo běžně používané ve fluorescenční mikroskopii.

Safranin

Safranin (nebo Safranine O) je červené kationtové barvivo. Váže se na jádra (DNA) a další tkáňové polyanionty, včetně glykosaminoglykanů v chrupavkách a žírných buňkách, a složek ligninu a plastidů v rostlinných tkáních. Safranin by neměl být zaměňován se šafránem, drahým přírodním barvivem, které se v některých metodách používá k dodání žluté barvy kolagenu, v kontrastu s modrou a červenou barvou poskytovanou jinými barvivy do jader a cytoplazmy ve zvířecích (včetně lidských) tkáních.

Běžně se používá nesprávný pravopis „safranin“. Konec -ine je vhodný pro safranin O, protože toto barvivo je amin,

Udržitelnost tkání

Tkáně, které zabírají skvrny, se nazývají chromatické . Chromozomy byly pojmenovány podle schopnosti absorbovat fialové skvrny.

Pozitivní afinita ke konkrétnímu barvení může být označena příponou -filský . Například tkáně, které se barví azurovým barvivem, mohou být označovány jako azurofilní . Toho lze také použít pro obecnější vlastnosti barvení, jako je acidofilní pro tkáně, které se barví kyselými barvami (zejména eosin ), bazofilní při barvení zásaditými barvivy a amfilní při barvení kyselými nebo zásaditými barvivy. Naproti tomu chromofobní tkáně nepřijímají barevné barvivo snadno.

Elektronová mikroskopie

Stejně jako ve světelné mikroskopii lze pro zvýšení kontrastu v transmisní elektronové mikroskopii použít skvrny . Obvykle se používají sloučeniny těžkých kovů s hustotou elektronů.

Kyselina fosforečná

Kyselina fosfotungová je běžným negativním barvivem pro viry , nervy , polysacharidy a další biologické tkáňové materiály. Většinou se používá ve formě 0,5-2% ph, čímž je neutrální, a je spárován s vodou za vzniku vodného roztoku. Kyselina fosforečná je naplněna elektronově hustou hmotou, která barví pozadí obklopující vzorek tmavě a samotný vzorek světle. Tento proces není normální pozitivní technikou barvení, kde je vzorek tmavý a pozadí zůstává světlé.

Oxid osmitý

Oxid osmitý se používá v optické mikroskopii k barvení lipidů . Rozpouští se v tucích a je organickými materiály redukován na elementární osmium, snadno viditelnou černou látku. Protože se jedná o těžký kov, který absorbuje elektrony, je to pravděpodobně nejběžnější barvivo používané pro morfologii v biologické elektronové mikroskopii. Používá se také pro barvení různých polymerů pro studium jejich morfologie pomocí TEM. OsO
₄je velmi těkavý a extrémně toxický. Je to silné oxidační činidlo, protože osmium má oxidační číslo +8. Agresivně oxiduje mnoho materiálů a zanechává za sebou ložisko netěkavého osmia v nižším oxidačním stavu.

Oxid rutenitý

Oxid ruthenitý je stejně těkavý a ještě agresivnější než oxid osmičelý a je schopen barvit i materiály, které odolávají skvrnám od osmi, např. Polyethylen.

Ostatní chemikálie používané v elektronové mikroskopie barvení zahrnují: molybdenan amonný , jodid kademnatý , karbohydrazidu , chlorid železitý , hexamin , indium chlorid , lanthanu (III) dusičnan , octan olovnatý , citrátem olovnatým , vedení (II) dusičnan , kyselinu jodistou , fosfomolybdenovou kyselinou , draselný ferikyanid , hexakyanoželeznatan draselný , ruthenium červená , dusičnan stříbrný , stříbrný proteinát , chloroaurate sodný , thalium dusičnan , thiosemikarbazid , uranylacetátem , dusičnan uranylu a vanadylu sulfát .

Viz také

• Komise pro biologické skvrny: Kontrola kvality a certifikace skvrn od třetích stran
• Cytologie : studium buněk
• Histologie : studium tkání
• Imunohistochemie : použití antisér ke značení specifických antigenů
• Ruthenium (II) tris (bathophenanthroline disulfonate) , proteinové barvivo.
• Vitální skvrna : skvrny, které nezabíjejí buňky
• STRÁNKA : separace proteinových molekul
• Barium klystýr - druh in vivo skvrny, která vytváří kontrast v rentgenové části světelného spektra
• Diafonizace

Reference

Další čtení

externí odkazy

Knihovní zdroje o barvení

Zdroje ve vaší knihovně Zdroje v jiných knihovnách

• Komise pro biologické skvrny je nezávislá nezisková společnost, která testuje barviva od počátku dvacátých let minulého století a vydává osvědčení o schválení šarží barev, která splňují mezinárodně uznávané standardy.
• StainsFile Reference pro barviva a techniky barvení.
• Vital Staining for Protozoa and related Temporary Mounting Techniques ~ Howey, 2000
• Když už mluvíme o fixaci: Část 1 a Část 2 - M. Halit Umar
• Mikrofotografie histologických skvrn
• Často kladené otázky při barvení na domovské stránce Sridhar Rao PN