Ultrafialová - viditelná spektroskopie - Ultraviolet–visible spectroscopy

Spektrofotometr Beckman DU640 UV / Vis

Ultrafialová viditelná spektroskopie nebo ultrafialová viditelná spektrofotometrie ( UV – Vis nebo UV / Vis ) označuje absorpční spektroskopii nebo reflexní spektroskopii v části ultrafialového záření a v úplných sousedních viditelných oblastech elektromagnetického spektra . To znamená, že používá světlo ve viditelném a sousedním rozsahu. Absorpce nebo odrazivost ve viditelném rozsahu přímo ovlivňují vnímanou barvu použitých chemikálií . V této oblasti spektra procházejí atomy a molekuly elektronickými přechody . Absorpční spektroskopie je komplementární k fluorescenční spektroskopii , protože fluorescence se zabývá přechody elektronů z excitovaného stavu do základního stavu , zatímco absorpce měří přechody ze základního stavu do excitovaného stavu.

Princip ultrafialové viditelné absorpce

Molekuly obsahující vazebné a nevazebné elektrony (n-elektrony) mohou absorbovat energii ve formě ultrafialového nebo viditelného světla a excitovat tyto elektrony na vyšší anti-vazebné molekulární orbitaly. Čím snadněji excitované elektrony (tj. Nižší energetická mezera mezi HOMO a LUMO ), tím delší vlnová délka světla může absorbovat. Existují čtyři možné typy přechodů (π – π *, n – π *, σ – σ * a n – σ *) a lze je uspořádat následovně: σ – σ *> n – σ *> π– π *> n – π *.

Aplikace

Příklad odečtu UV / Vis

UV / Vis spektroskopie se běžně používá v analytické chemii pro kvantitativní stanovení různých analytů, jako jsou ionty přechodných kovů , vysoce konjugované organické sloučeniny a biologické makromolekuly. Spektroskopická analýza se běžně provádí v roztocích, ale lze studovat také pevné látky a plyny.

  • Roztoky iontů přechodných kovů mohou být zabarveny (tj. Absorbovat viditelné světlo), protože d elektrony v atomech kovů mohou být excitovány z jednoho elektronického stavu do druhého. Barva roztoků kovových iontů je silně ovlivněna přítomností jiných druhů, jako jsou určité anionty nebo ligandy . Například barva zředěného roztoku síranu měďnatého je velmi světle modrá; přidání amoniaku zesiluje barvu a mění vlnovou délku maximální absorpce (λ max ).
  • Organické sloučeniny , zejména ty s vysokým stupněm konjugace , také absorbují světlo v UV nebo viditelných oblastech elektromagnetického spektra . Rozpouštědly pro tato stanovení jsou často voda pro sloučeniny rozpustné ve vodě nebo ethanol pro sloučeniny rozpustné v organismu. (Organická rozpouštědla mohou mít značnou absorpci UV; ne všechna rozpouštědla jsou vhodná pro použití v UV spektroskopii. Ethanol absorbuje velmi slabě při většině vlnových délek.) Polarita rozpouštědla a pH mohou ovlivnit absorpční spektrum organické sloučeniny. Tyrosin například zvyšuje absorpční maxima a molární extinkční koeficient, když se pH zvýší ze 6 na 13 nebo když se sníží polarita rozpouštědla.
  • Zatímco komplexy přenosu náboje také způsobují vznik barev, barvy jsou často příliš intenzivní, než aby byly použity pro kvantitativní měření.

Zákon Beer-Lambert uvádí, že absorbance roztoku je přímo úměrná koncentraci absorbujících druhů v roztoku a délky dráhy. Pro pevnou délku dráhy lze tedy ke stanovení koncentrace absorbéru v roztoku použít UV / Vis spektroskopii. Je nutné vědět, jak rychle se absorbance mění s koncentrací. To lze vzít z referencí (tabulky molárních extinkčních koeficientů ) nebo přesněji z kalibrační křivky .

Jako detektor pro HPLC může být použit UV / Vis spektrofotometr . Přítomnost analytu dává odezvu, o které se předpokládá, že je úměrná koncentraci. Pro dosažení přesných výsledků je třeba porovnat odezvu přístroje na analyt v neznámém stavu s odezvou na standard; to je velmi podobné použití kalibračních křivek. Odezva (např. Výška píku) pro konkrétní koncentraci je známá jako faktor odezvy .

Vlnové délky absorpčních vrcholů mohou být korelovány s typy vazeb v dané molekule a jsou cenné při určování funkčních skupin v molekule. Například Woodward – Fieserova pravidla jsou souborem empirických pozorování používaných k předpovědi λ max , vlnové délky nejintenzivnější absorpce UV / Vis, pro konjugované organické sloučeniny, jako jsou dieny a ketony . Samotné spektrum však není specifickým testem pro daný vzorek. Povaha rozpouštědla, pH roztoku, teplota, vysoké koncentrace elektrolytu a přítomnost interferujících látek mohou ovlivnit absorpční spektrum. Spektrum také změní experimentální variace, jako je šířka štěrbiny (efektivní šířka pásma) spektrofotometru. Chcete-li použít UV / Vis spektroskopii k analýze, je nutné tyto proměnné kontrolovat nebo zohlednit, aby bylo možné identifikovat přítomné látky.

Metoda se nejčastěji používá kvantitativním způsobem ke stanovení koncentrací absorbujících druhů v roztoku pomocí zákona Beer-Lambert :

,

kde je naměřená absorbance (v jednotkách absorbance (AU)), je intenzita dopadajícího světla v daném vlnové délce , je přenášen intenzita, L délka dráhy skrze vzorek, a c je koncentrace absorbující druhu. Pro každý druh a vlnovou délku je ε konstanta známá jako molární absorpční nebo extinkční koeficient. Tato konstanta je základní molekulární vlastností v daném rozpouštědle při určité teplotě a tlaku a má jednotky .

Absorpce a extinkce ε jsou někdy definovány z hlediska přirozeného logaritmu namísto logaritmu base-10.

Beer-Lambertův zákon je užitečný pro charakterizaci mnoha sloučenin, ale neplatí jako univerzální vztah pro koncentraci a absorpci všech látek. S polynomiálním vztahem 2. řádu mezi absorpcí a koncentrací se někdy setkáváme u velmi velkých a složitých molekul, jako jsou organická barviva (například Xylenol Orange nebo Neutral Red ).

UV – Vis spektroskopie se také používá v polovodičovém průmyslu k měření tloušťky a optických vlastností tenkých vrstev na destičce. UV – Vis spektrometry se používají k měření odrazivosti světla a lze je analyzovat pomocí disperzních rovnic Forouhi – Bloomer pro stanovení indexu lomu (n) a extinkčního koeficientu (k) daného filmu v celém měřeném spektrálním rozsahu.

Praktické úvahy

Zákon Beer-Lambert má implicitní předpoklady, které je třeba experimentálně splnit, aby mohl platit; jinak existuje možnost odchylek od zákona. Například chemický makeup a fyzikální prostředí vzorku mohou změnit jeho extinkční koeficient. Aby byly závěry platné, musí se chemické a fyzikální podmínky zkušebního vzorku shodovat s referenčními měřeními. Celosvětově lékopisy, jako je americký (USP) a evropský (Ph. Eur.) Lékopis, vyžadují, aby spektrofotometry fungovaly podle přísných regulačních požadavků zahrnujících faktory, jako je rozptýlené světlo a přesnost vlnové délky.

Spektrální šířka pásma

Pro světlo dopadající na buňku vzorku je důležité mít monochromatický zdroj záření. Monochromaticita se měří jako šířka „trojúhelníku“ tvořeného špičkou intenzity, v jedné polovině intenzity vrcholu. Daný spektrometr má spektrální šířku pásma, která charakterizuje, jak monochromatické je dopadající světlo. Pokud je tato šířka pásma srovnatelná s šířkou absorpční čáry (nebo větší než) , pak bude naměřený extinkční koeficient chybný. Při referenčních měřeních je šířka pásma přístroje (šířka pásma dopadajícího světla) udržována pod šířkou spektrálních čar. Při měření zkušebního materiálu by měla být také dostatečně úzká šířka pásma dopadajícího světla. Snížení spektrální šířky pásma snižuje energii předanou detektoru, a proto bude vyžadovat delší dobu měření, aby se dosáhlo stejného poměru signálu k šumu.

Chyba vlnové délky

V kapalinách se extinkční koeficient obvykle mění s vlnovou délkou pomalu. Vrchol křivky absorbance (vlnová délka, kde absorbance dosahuje maxima) je tam, kde je rychlost změny absorbance s vlnovou délkou nejmenší. Měření se obvykle provádějí ve špičce, aby se minimalizovaly chyby způsobené chybami vlnové délky v přístroji, což jsou chyby způsobené odlišným extinkčním koeficientem, než se předpokládalo.

Bludné světlo

Dalším důležitým faktorem je čistota použitého světla. Nejdůležitějším faktorem, který to ovlivňuje, je úroveň rozptýleného světla monochromátoru .

Použitý detektor je širokopásmový; reaguje na všechno světlo, které k němu dosáhne. Pokud významné množství světla procházejícího vzorkem obsahuje vlnové délky, které mají mnohem nižší extinkční koeficienty než nominální, přístroj ohlásí nesprávně nízkou absorbanci. Jakýkoli nástroj dosáhne bodu, kdy zvýšení koncentrace vzorku nebude mít za následek zvýšení hlášené absorbance, protože detektor jednoduše reaguje na rozptýlené světlo. V praxi musí být koncentrace vzorku nebo délka optické dráhy upravena tak, aby se neznámá absorbance nacházela v rozsahu platném pro přístroj. Někdy je vyvinuta empirická kalibrační funkce využívající známé koncentrace vzorku, která umožňuje měření do oblasti, kde se přístroj stává nelineárním.

Jako hrubý průvodce by měl nástroj s jediným monochromátorem typicky rozptýlenou úroveň světla odpovídající přibližně 3 absorpčním jednotkám (AU), což by způsobilo měření nad přibližně 2 AU problematické. Složitější nástroj s dvojitým monochromátorem by měl rozptýlenou úroveň světla odpovídající přibližně 6 AU, což by tedy umožnilo měřit mnohem širší rozsah absorbance.

Odchylky od zákona Beer-Lambert

Při dostatečně vysokých koncentracích budou absorpční pásy nasyceny a projeví se zploštění absorpce. Zdá se, že absorpční pík se zplošťuje, protože téměř 100% světla je již absorbováno. Koncentrace, při které k tomu dochází, závisí na konkrétní měřené sloučenině. Jeden test, který lze použít k testování tohoto efektu, je změna délky dráhy měření. V zákonu Beer-Lambert má různá koncentrace a délka dráhy ekvivalentní účinek - ředění roztoku o faktor 10 má stejný účinek jako zkrácení délky cesty o faktor 10. Pokud jsou k dispozici buňky různých délek dráhy, testování pokud tento vztah platí, je jeden způsob, jak posoudit, zda dochází ke zploštění absorpce.

Řešení, která nejsou homogenní, mohou vykazovat odchylky od Beer-Lambertova zákona kvůli fenoménu zploštění absorpce. To se může stát například tam, kde je absorbující látka umístěna uvnitř suspendovaných částic. Odchylky budou nejvíce patrné za podmínek nízké koncentrace a vysoké absorbance. Poslední reference popisuje způsob korekce této odchylky.

Některá řešení, jako je chlorid měďnatý ve vodě, se vizuálně mění při určité koncentraci kvůli změněným podmínkám kolem barevného iontu (dvojmocný iont mědi). U chloridu měďnatého to znamená posun od modré k zelené, což by znamenalo, že by se monochromatické měření odchýlilo od Beer-Lambertova zákona.

Zdroje nejistoty měření

Výše uvedené faktory přispívají k nejistotě měření výsledků získaných pomocí UV / Vis spektrofotometrie. Pokud se v kvantitativní chemické analýze používá UV / Vis spektrofotometrie, pak jsou výsledky navíc ovlivněny zdroji nejistoty vyplývajícími z povahy měřených sloučenin a / nebo roztoků. Patří mezi ně spektrální interference způsobené překrytím absorpčních pásem, vyblednutí barvy absorbujících druhů (způsobené rozkladem nebo reakcí) a možný nesoulad složení mezi vzorkem a kalibračním roztokem.

Ultrafialový viditelný spektrofotometr

Nástroj použitý v ultrafialové-viditelné spektroskopie se nazývá UV / Vis spektrofotometr . Měří intenzitu světla po průchodu vzorkem ( ) a porovnává ji s intenzitou světla před průchodem vzorkem ( ). Poměr se nazývá propustnost a obvykle se vyjadřuje v procentech (% T). Absorbance , se na základě propustnosti:

UV-viditelný spektrofotometr lze také nakonfigurovat pro měření odrazivosti. V tomto případě spektrofotometr měří intenzitu světla odraženého od vzorku ( ) a porovnává ji s intenzitou světla odraženého od referenčního materiálu ( ) (například bílé dlaždice). Poměr se nazývá odrazivost a obvykle se vyjadřuje v procentech (% R).

Základními částmi spektrofotometru jsou světelný zdroj, držák vzorku, difrakční mřížka v monochromátoru nebo hranol k oddělení různých vlnových délek světla a detektor. Zdrojem záření je často wolframové vlákno (300–2500 nm), deuteriová oblouková lampa , která je kontinuální přes ultrafialovou oblast (190–400 nm), xenonová oblouková lampa , která je kontinuální od 160 do 2 000 nm; nebo nověji světelné diody (LED) pro viditelné vlnové délky. Detektorem je obvykle fotonásobič , fotodioda , fotodiodové pole nebo nábojově vázané zařízení (CCD). Detektory jedné fotodiody a fotonásobiče se používají se skenovacími monochromátory, které filtrují světlo tak, že k detektoru dosáhne najednou pouze světlo jedné vlnové délky. Skenovací monochromátor posune difrakční mřížku na „krokovou“ každou vlnovou délku, takže jeho intenzitu lze měřit jako funkci vlnové délky. U CCD a fotodiodových polí se používají pevné monochromátory. Jelikož obě tato zařízení sestávají z mnoha detektorů seskupených do jedno nebo dvourozměrných polí, jsou schopna sbírat světlo různých vlnových délek na různých pixelech nebo skupinách pixelů současně.

Zjednodušené schéma dvojitého paprsku UV - viditelného spektrofotometru

Spektrofotometr může být buď jednopaprskový nebo dvojpaprskový . V přístroji s jedním paprskem (například Spectronic 20 ) prochází veškeré světlo skrz celu se vzorkem. musí být měřeno odebráním vzorku. Jednalo se o nejranější design a stále se běžně používá v učebních i průmyslových laboratořích.

V nástroji s dvojitým paprskem je světlo rozděleno na dva paprsky, než dosáhne vzorku. Jako reference je použit jeden paprsek; druhý paprsek prochází vzorkem. Intenzita referenčního paprsku se bere jako 100% propustnost (nebo 0 absorbance) a zobrazené měření je poměrem dvou intenzit paprsku. Některé přístroje s dvojitým paprskem mají dva detektory (fotodiody) a současně se měří vzorkovací a referenční paprsek. V jiných nástrojích procházejí dva paprsky paprskovým vrtulníkem , který blokuje jeden paprsek po druhém. Detektor střídavě měří paprsek vzorku a referenční paprsek synchronně s vrtulníkem. V cyklu vrtulníku může být také jeden nebo více temných intervalů. V tomto případě lze naměřené intenzity paprsku korigovat odečtením intenzity naměřené v tmavém intervalu před provedením poměru.

U jednopaprskového přístroje musí být nejprve změřena kyveta obsahující pouze rozpouštědlo. Mettler Toledo vyvinul spektrofotometr s jedním paprskovým polem, který umožňuje rychlé a přesné měření v rozsahu UV / VIS. Světelný zdroj se skládá z xenonové výbojky pro ultrafialové (UV) i viditelné (VIS) a oblasti blízké infračervené vlnové délky pokrývající spektrální rozsah od 190 do 1100 nm. Záblesky lampy jsou zaměřeny na skleněné vlákno, které pohání paprsek světla na kyvetu obsahující roztok vzorku. Paprsek prochází vzorkem a specifické vlnové délky jsou absorbovány složkami vzorku. Zbývající světlo se shromažďuje za kyvetou skleněným vláknem a vhání se do spektrografu. Spektrograf se skládá z difrakční mřížky, která odděluje světlo do různých vlnových délek, a CCD senzoru pro záznam dat. Celé spektrum je tedy současně měřeno, což umožňuje rychlý záznam.

Vzorky pro UV / Vis spektrofotometrii jsou nejčastěji kapaliny, i když lze měřit také absorbanci plynů a dokonce i pevných látek. Vzorky se obvykle umisťují do průhledné buňky známé jako kyveta . Kyvety mají obvykle obdélníkový tvar, obvykle s vnitřní šířkou 1 cm. (Tato šířka se podle zákona Beer-Lambert stává délkou dráhy .) Zkumavky lze v některých nástrojích použít také jako kyvety. Použitý typ nádoby na vzorky musí umožňovat průchod záření přes sledovanou spektrální oblast. Nejběžněji použitelné kyvety jsou vyrobeny z vysoce kvalitního taveného křemene nebo křemenného skla, protože jsou průhledné v celém UV, viditelném a blízkém infračerveném regionu. Skleněné a plastové kyvety jsou také běžné, i když sklo a většina plastů absorbují UV záření, což omezuje jejich užitečnost na viditelné vlnové délky.

Byly také vyrobeny speciální nástroje. Patří mezi ně připojení spektrofotometrů k dalekohledům pro měření spekter astronomických prvků. UV-viditelné mikrospektrofotometry se skládají z UV-viditelného mikroskopu integrovaného s UV-viditelným spektrofotometrem.

Kompletní spektrum absorpce na všech sledovaných vlnových délkách lze často vytvořit přímo pomocí sofistikovanějšího spektrofotometru. U jednodušších přístrojů se absorpce určuje po jedné vlnové délce a operátor ji poté kompiluje do spektra. Odstraněním závislosti na koncentraci lze stanovit extinkční koeficient (ε) jako funkci vlnové délky.

Mikrospektrofotometrie

UV-viditelná spektroskopie mikroskopických vzorků se provádí integrací optického mikroskopu s UV-viditelnou optikou, zdroji bílého světla, monochromátorem a citlivým detektorem, jako je nábojově vázané zařízení (CCD) nebo fotonásobič (PMT). Jelikož je k dispozici pouze jedna optická cesta, jedná se o jednopaprskové přístroje. Moderní přístroje jsou schopné měřit UV-viditelná spektra jak v odrazivosti, tak v přenosu vzorkovacích oblastí v mikronovém měřítku. Výhodou použití těchto nástrojů je, že jsou schopny měřit mikroskopické vzorky, ale jsou také schopny měřit spektra větších vzorků s vysokým prostorovým rozlišením. Jako takové se používají ve forenzní laboratoři k analýze barviv a pigmentů v jednotlivých textilních vláknech, mikroskopických barevných třísek a barvy skleněných fragmentů. Používají se také ve vědě o materiálech a biologickém výzkumu a pro stanovení energetického obsahu uhlí a ropných zdrojů měřením odrazivosti vitrinitu . Mikrospektrofotometry se používají v polovodičovém a mikrooptickém průmyslu pro monitorování tloušťky tenkých vrstev po jejich nanesení. V polovodičovém průmyslu se používají, protože kritické rozměry obvodů jsou mikroskopické. Typický test polovodičové destičky by vyžadoval získání spektra z mnoha bodů na vzorované nebo nevzorované destičce. Tloušťku nanesených filmů lze vypočítat z interferenčního vzoru spektra. Kromě toho lze ke stanovení tloušťky použít ultrafialově viditelnou spektrofotometrii spolu s indexem lomu a extinkčním koeficientem tenkých vrstev, jak je popsáno v indexu lomu a extinkčním koeficientu tenkovrstvých materiálů . Poté lze vygenerovat mapu tloušťky filmu přes celou destičku a použít ji pro účely kontroly kvality.

Další aplikace

K určení kinetiky nebo rychlostní konstanty chemické reakce lze použít UV / Vis . Reakce, ke které dochází v roztoku, musí vykazovat posun barvy nebo jasu od reaktantů k produktům, aby bylo možné pro tuto aplikaci použít UV / Vis. Například molekula rtuti dithizonát má ve zředěném roztoku žlutooranžovou barvu (1 x 10 ^ -5 M) a modře se modří, když je vystavena zvláštním vlnovým délkám viditelného světla (a UV) prostřednictvím konformační změny, ale tato reakce je reverzibilní zpět do žlutého „základního stavu“.

Použitím optických vláken jako transmisního prvku spektra spalujících plynů je možné určit chemické složení paliva, teplotu plynů a poměr vzduch-palivo.

Konstantu rychlosti konkrétní reakce lze určit měřením absorbčního spektra UV / Vis ve specifických časových intervalech. Jako příklad lze znovu použít rtuťový dithizonát, který může na vzorek zazářit, aby se roztok zbarvil modře, a poté každých 10 sekund (proměnná) spustit UV / Vis test, aby bylo vidět, jak se hladiny absorbovaných a odražených vlnových délek v průběhu času mění v souladu s řešení se z excitovaného stavu modré energie vrátí zpět do žluté. Z těchto měření lze vypočítat koncentraci těchto dvou druhů. Reakce rtuťového dithizonátu z jedné konformace na druhou je prvního řádu a měla by integrální zákon o rychlosti prvního řádu: ln [A] (čas t) = - kt + ln [A] (počáteční). Grafy přirozeného logaritmu (ln) koncentrace [A] v závislosti na čase proto budou grafovat přímku se sklonem -k nebo zápornou rychlostní konstantou. Různé rychlostní objednávky mají různé integrované rychlostní zákony v závislosti na mechanismu reakce.

Rovnovážnou konstantu lze také vypočítat pomocí UV / Vis spektroskopie. Po stanovení optimálních vlnových délek pro všechny druhy podílející se na rovnováze může být reakce spuštěna do rovnováhy a koncentrace druhů určena ze spektroskopie při různých známých vlnových délkách. Rovnovážnou konstantu lze vypočítat jako K (ekv.) = [Produkty] / [Reaktanty].

Viz také

Reference