Western blot - Western blot
Western blot (někdy nazývá protein imunoblot ), nebo Western blot , je široce používaný analytická technika v molekulární biologii a imunogenetiky k detekci specifických proteinů ve vzorku tkáňového homogenátu nebo extraktu.
Technika Western blot využívá ke splnění svého úkolu oddělení konkrétního proteinu od komplexu tři prvky: separace podle velikosti, přenos proteinu na pevný podklad a označení cílového proteinu pomocí primární a sekundární protilátky k vizualizaci. Je vytvořena syntetická nebo zvířecí protilátka (známá jako primární protilátka ), která rozpoznává specifický cílový protein a váže se na něj. Membrána pro elektroforézu se promyje v roztoku obsahujícím primární protilátku, než se přebytečná protilátka smyje. Přidá se sekundární protilátka, která rozpoznává primární protilátku a váže se na ni. Sekundární protilátka je vizualizována různými způsoby, jako je barvení , imunofluorescence a radioaktivita, což umožňuje nepřímou detekci specifického cílového proteinu.
Mezi další související techniky patří dot blot analýza, kvantitativní dot blot , imunohistochemie a imunocytochemie , kde se protilátky používají k detekci proteinů v tkáních a buňkách pomocí imunoznačení a enzymaticky vázaný imunosorbentní test (ELISA).
Název western blot je hrou na Southern blot , techniku pro detekci DNA pojmenovanou po jejím vynálezci, anglickém biologovi Edwinu Southernovi . Podobně je detekce RNA označována jako Northern blot . Pojem „western blot“ dal W. Neal Burnette v roce 1981, i když samotná metoda vznikla v roce 1979 v laboratoři Harryho Towbina na institutu Friedricha Mieschera v Basileji ve Švýcarsku . V letech 1979 až 2019 „bylo zmíněno v názvech, abstraktech a klíčových slovech více než 400 000 publikací uvedených v publikaci PubMed “ a stále může být nejpoužívanější technikou proteinové analýzy.
Aplikace
Western blot je široce používán v biochemii pro kvalitativní detekci jednotlivých proteinů a proteinových modifikací (jako jsou posttranslační modifikace ). Odhaduje se, že alespoň 8-9% všech publikací souvisejících s proteiny používá western blot. Používá se jako obecná metoda k identifikaci přítomnosti konkrétního jediného proteinu ve složité směsi proteinů. Semikvantitativní odhad proteinu lze odvodit z velikosti a barevné intenzity proteinového pásu na blotové membráně. Kromě toho lze použít řadu ředění purifikovaného proteinu známých koncentrací, aby byl umožněn přesnější odhad koncentrace proteinu. Western blot se běžně používá k ověření produkce proteinů po klonování . Používá se také v lékařské diagnostice, např. V testu HIV nebo BSE -Test.
Potvrzující test HIV využívá western blot k detekci protilátky proti HIV ve vzorku lidského séra . Proteiny ze známých buněk infikovaných HIV se oddělí a vysají na membránu, jak je uvedeno výše. Poté se testované sérum aplikuje v kroku inkubace primární protilátky; volná protilátka se odplaví a přidá se sekundární anti-lidská protilátka navázaná na enzymový signál. Zbarvené pásy pak označují proteiny, na které sérum pacienta obsahuje protilátku. Western blot se také používá jako konečný test pro variantní Creutzfeldt-Jakobovu chorobu , typ prionové choroby související se spotřebou kontaminovaného hovězího dobytka s bovinní spongiformní encefalopatií (BSE, běžně označovanou jako „nemoc šílených krav“).
Další aplikace je v diagnostice tularémie. Vyhodnocení schopnosti western blotu detekovat protilátky proti F. tularensis ukázalo, že jeho citlivost je téměř 100% a specificita 99,6%.
Některé formy testování na Lyme nemoc využívají westernový přenos. Western blot lze také použít jako potvrzovací test na infekci hepatitidou B a HSV-2 (typ 2 herpesu). Ve veterinární medicíně se pro potvrzení statusu FIV + u koček někdy používá western blot .
Mezi další aplikace metody western blot patří její použití Světovou antidopingovou agenturou (WADA) . Krevní doping je zneužití určitých technik a/nebo látek ke zvýšení hmotnosti červených krvinek, což umožňuje tělu transportovat do svalů více kyslíku, a tím zvýšit vytrvalost a výkon. K dopingu krve se používají tři široce známé látky nebo metody, a to erytropoetin (EPO), syntetické nosiče kyslíku a krevní transfuze. Každý je zakázán podle seznamu zakázaných látek a metod WADA. Technika western blot byla použita během mistrovství světa ve fotbale 2014 v antidopingové kampani pro tuto událost. Celkem bylo odebráno a analyzováno více než 1 000 vzorků Reichelem a kol. v akreditované laboratoři WADA ve švýcarském Lausanne. Nedávný výzkum využívající techniku Western blot ukázal zlepšenou detekci EPO v krvi a moči na základě nových horizontálních gelů prefabrikovaných Velum SAR optimalizovaných pro rutinní analýzu. S přijetím horizontální SAR-PAGE v kombinaci s prefabrikovanými gely Velum SAR na bázi filmu byla výrazně zvýšena diskriminační schopnost aplikace rEPO v mikro dávkách.
Postup
Metoda western blot se skládá z gelové elektroforézy k oddělení nativních proteinů strukturou 3-D nebo denaturovaných proteinů podle délky polypeptidu, následovaného elektroforetickým přenosem na membránu (většinou PVDF nebo nitrocelulóza ) a imunologickým postupem pro vizualizaci určitý protein na blotové membráně. SDS-PAGE se obecně používá pro denaturační elektroforetickou separaci proteinů. SDS se obecně používá jako pufr (stejně jako v gelu), aby všechny přítomné proteiny získaly jednotný negativní náboj, protože proteiny mohou být nabité kladně, záporně nebo neutrálně. Tento typ elektroforézy je známý jako SDS-PAGE (SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza). Před elektroforézou se vzorky proteinů často vaří, aby se denaturovaly přítomné proteiny. To zajišťuje oddělení proteinů podle velikosti a brání proteázám (enzymům, které štěpí proteiny) v degradaci vzorků. Po elektroforetické separaci jsou proteiny přeneseny na membránu (typicky nitrocelulóza nebo PVDF ). Membrána je pak často obarvena Ponceau S za účelem vizualizace proteinů na blotu a zajištění správného přenosu. Poté jsou proteiny blokovány mlékem (nebo jinými blokovacími činidly), aby se zabránilo vazbě nespecifických protilátek, a poté se obarví protilátkami specifickými pro cílový protein. Nakonec bude membrána obarvena sekundární protilátkou, která rozpoznává první barvení protilátky, kterou lze poté použít k detekci řadou metod. Krok gelové elektroforézy je zahrnut v analýze westernovým přenosem, aby se vyřešil problém zkřížené reaktivity protilátek.
Gelová elektroforéza
Proteiny vzorku se oddělí pomocí gelové elektroforézy . Oddělení proteinů může být izoelektrickým bodem (pl), molekulovou hmotností , elektrickým nábojem nebo kombinací těchto faktorů. Povaha separace závisí na zpracování vzorku a povaze gelu.
Zdaleka nejběžnější typ gelové elektroforézy využívá polyakrylamidové gely a pufry naplněné dodecylsulfátem sodným (SDS). SDS-PAGE (SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza) udržuje polypeptidy v denaturovaném stavu poté, co byly ošetřeny silnými redukčními činidly k odstranění sekundární a terciární struktury (např. Disulfidové vazby [SS] na sulfhydrylové skupiny [SH a SH]) a umožňuje tak separaci bílkovin podle jejich molekulární hmotnosti. Vzorky proteinů se zakryjí v záporně nabitém SDS, účinně se stanou aniontovými a migrují přes kladně nabitou (vyšší napětí) anodu (obvykle s červeným vodičem) přes akrylamidovou síťku gelu. Menší proteiny migrují rychleji touto sítí a proteiny jsou tak rozděleny podle velikosti (obvykle měřeno v kilodaltonech, kDa ). Koncentrace akrylamidu určuje rozlišení gelu - čím vyšší je koncentrace akrylamidu, tím lepší je rozlišení proteinů s nižší molekulovou hmotností. Čím nižší je koncentrace akrylamidu, tím lepší je rozlišení proteinů s vyšší molekulovou hmotností. Proteiny pro většinu blotů cestují po gelu pouze v jedné dimenzi.
Vzorky se vloží do jamek v gelu. Jedna dráha je obvykle vyhrazena pro marker nebo žebřík , což je komerčně dostupná směs proteinů známých molekulových hmotností, typicky obarvená tak, aby vytvářela viditelné, barevné pásy. Když je na gel aplikováno napětí , proteiny přes něj migrují různými rychlostmi v závislosti na jejich velikosti. Tyto různé rychlosti pokroku (různé elektroforetické pohyblivosti ) se rozdělují do pásem v každém pruhu . Proteinové pásy lze poté porovnat s žebříčkovými pásy, což umožňuje odhad molekulové hmotnosti proteinu.
Je také možné použít dvourozměrný gel, který šíří proteiny z jednoho vzorku ve dvou rozměrech. Proteiny jsou rozděleny podle izoelektrického bodu (pH, při kterém mají neutrální čistý náboj) v první dimenzi, a podle jejich molekulové hmotnosti v druhé dimenzi.
Převod
Aby byly proteiny přístupné detekci protilátek, jsou přesunuty zevnitř gelu na membránu, pevnou podložku, je to nezbytná součást procesu. Existují dva typy membrán: nitrocelulóza (NC) nebo polyvinyliden difluorid (PVDF ). NC membrána má vysokou afinitu k proteinu a jeho retenčním schopnostem. NC je však křehký a neumožňuje použití blotu k opětovnému sondování, zatímco membrána PVDF umožňuje blot znovu sondovat. Nejčastěji používanou metodou přenosu proteinů se nazývá elektroblotování . Elektroblotování používá elektrický proud k tažení negativně nabitých proteinů z gelu směrem k kladně nabité anodě a do PVDF nebo NC membrány. Proteiny se pohybují zevnitř gelu na membránu při zachování organizace, kterou v gelu měli. Starší způsob přenosu zahrnuje umístění membrány na gel a na něj stoh filtračních papírů. Celá hromádka je umístěna v pufrovacím roztoku, který kapilárním působením posouvá papír nahoru a přináší s sebou proteiny. V praxi se tato metoda běžně nepoužívá kvůli dlouhé době procedury.
V důsledku obou přenosových procesů jsou proteiny exponovány na tenké membránové vrstvě pro detekci. Obě odrůdy membrán jsou vybrány pro jejich nespecifické vazebné vlastnosti na proteiny (tj. Váže všechny proteiny stejně dobře). Vazba na bílkoviny je založena na hydrofobních interakcích, stejně jako na nabitých interakcích mezi membránou a proteinem. Nitrocelulózové membrány jsou levnější než PVDF, ale jsou mnohem křehčí a nevydrží opakované zkoumání.
Celkové barvení bílkovin
Celkové barvení proteinu umožňuje vizualizaci celkového proteinu, který byl úspěšně přenesen na membránu, což uživateli umožňuje zkontrolovat jednotnost přenosu proteinu a provést následnou normalizaci cílového proteinu se skutečným množstvím proteinu na dráhu. Normalizace pomocí takzvané "nakládací kontroly" byla založena na imunologickém barvení domácích proteinů v klasickém postupu, ale v poslední době směřuje k celkovému barvení proteinů, a to z důvodu mnoha výhod. Pro normalizaci western blot bylo popsáno nejméně sedm různých přístupů pro barvení celkových proteinů: Ponceau S , techniky bez barvení, Sypro Ruby, Epicocconone , Coomassie R-350 , Amido Black a Cy5 . Aby se zabránilo šumu signálu, mělo by být před blokováním membrány provedeno barvení celkového proteinu. Nicméně bylo popsáno také barvení po protilátce.
Blokování
Vzhledem k tomu, že membrána byla vybrána pro svou schopnost vázat protein a protože jak protilátky, tak cíl jsou proteiny, je třeba učinit kroky k zabránění interakcí mezi membránou a protilátkou použitou k detekci cílového proteinu. Blokování nespecifické vazby je dosaženo umístěním membrány do zředěného roztoku bílkovin-obvykle 3–5% hovězího sérového albuminu (BSA) nebo netučného sušeného mléka (obojí je levné) ve fyziologickém roztoku pufrovaném tris (TBS) nebo I-Block, s minutovým procentem (0,1%) detergentu, jako je Tween 20 nebo Triton X-100 . Přestože je díky své dostupnosti preferováno beztučné suché mléko, je zapotřebí vhodné blokovací řešení, protože ne všechny bílkoviny v mléce jsou kompatibilní se všemi detekčními pásy. Protein ve zředěném roztoku se přichytí k membráně na všech místech, kde se cílové proteiny nepřipojily. Když se tedy přidá protilátka, nemůže se vázat na membránu, a proto je jediným dostupným vazebným místem specifický cílový protein. To snižuje pozadí konečného produktu western blotu, což vede k jasnějším výsledkům a eliminuje falešně pozitivní výsledky.
Inkubace
Během procesu detekce je membrána "testována" na požadovaný protein s modifikovanou protilátkou, která je spojena s reportérovým enzymem; když je vystaven vhodnému substrátu, tento enzym řídí kolorimetrickou reakci a vytváří barvu. Z různých důvodů se to tradičně odehrává ve dvou krocích, ačkoli pro určité aplikace jsou nyní k dispozici jednokrokové metody detekce.
Primární protilátka
Tyto primární protilátky jsou vytvářeny, když se hostitelské druhy nebo imunitní buněčné kultury vystaveny proteinu (nebo jeho části). Normálně je to součástí imunitní odpovědi, zatímco zde jsou sklizeny a použity jako citlivé a specifické detekční nástroje, které váží protein přímo.
Po blokování se roztok primární protilátky (obvykle mezi 0,5 a 5 mikrogramů/ml) zředěný buď promývacím pufrem PBS nebo TBST inkubuje s membránou za mírného míchání typicky hodinu při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 ° C. roztok protilátky se inkubuje s membránou po dobu 30 minut až přes noc. Může být také inkubován při různých teplotách, přičemž nižší teploty jsou spojeny s větší vazbou, a to jak specifické (k cílovému proteinu, „signál“), tak nespecifické („šum“). Po inkubaci se membrána několikrát promyje promývacím pufrem, aby se odstranila nevázaná primární protilátka, a tím se minimalizovalo pozadí. Roztok promývacího pufru se obvykle skládá z pufrovaného fyziologického roztoku s malým procentem detergentu a někdy z práškového mléka nebo BSA.
Sekundární protilátka
Po opláchnutí membrány k odstranění nevázané primární protilátky je membrána vystavena jiné protilátce známé jako sekundární protilátka . Protilátky pocházejí ze zvířecích zdrojů (nebo hybridomových kultur živočišného původu ). Sekundární protilátka rozpoznává a váže se na druhově specifickou část primární protilátky. Protimyší sekundární protilátka se proto bude vázat na téměř jakoukoli primární protilátku pocházející z myší a může být označována jako „protidruhová“ protilátka (např. Anti-myší, anti-kozí atd.). Aby byla umožněna detekce cílového proteinu, je sekundární protilátka běžně spojena s biotinem nebo reportérovým enzymem, jako je alkalická fosfatáza nebo křenová peroxidáza . To znamená, že několik sekundárních protilátek se váže na jednu primární protilátku a zesiluje signál, což umožňuje detekci proteinů s mnohem nižší koncentrací, než by bylo viditelné samotnou SDS-PAGE.
Křenová peroxidáza (HRP) je běžně spojena se sekundárními protilátkami, což umožňuje detekci cílového proteinu chemiluminiscencí . Chemiluminiscenční substrát je štěpen HRP, což vede k produkci luminiscence . Produkce luminiscence je tedy úměrná množství sekundární protilátky konjugované s HRP, a proto nepřímo měří přítomnost cílového proteinu. Citlivý list fotografického filmu je umístěn proti membráně a expozice světlu z reakce vytvoří obraz protilátek navázaných na skvrnu. Levnější, ale méně citlivý přístup využívá barvení 4-chlornaftolem s 1% peroxidem vodíku ; reakce peroxidových radikálů se 4-chlornaftolem vytváří tmavě purpurové skvrny, které lze fotografovat bez použití specializovaného fotografického filmu.
Stejně jako u postupů ELISPOT a ELISA může být enzymu poskytnuta molekula substrátu, která bude enzymem přeměněna na barevný reakční produkt, který bude viditelný na membráně (viz obrázek níže s modrými pruhy).
Další metoda detekce sekundárních protilátek využívá protilátku spojenou s fluoroforem blízkou infračervenou (NIR). Světlo produkované excitací fluorescenčního barviva je statické, což činí fluorescenční detekci přesnějším a přesnějším měřením rozdílu v signálu produkovaném značenými protilátkami navázanými na proteiny na westernovém přenosu. Proteiny lze přesně kvantifikovat, protože signál generovaný různým množstvím proteinů na membránách se měří ve statickém stavu ve srovnání s chemiluminiscencí, ve které se světlo měří v dynamickém stavu.
Třetí alternativou je použít spíše radioaktivní značku než enzym spojený se sekundární protilátkou, jako je značení proteinu vázajícího protilátku, jako je Staphylococcus Protein A nebo Streptavidin, radioaktivním izotopem jodu. Protože jiné metody jsou bezpečnější, rychlejší a levnější, tato metoda se nyní používá jen zřídka; výhodou tohoto přístupu je však citlivost zobrazování založeného na auto-radiografii, která umožňuje vysoce přesnou kvantifikaci proteinu v kombinaci s optickým softwarem (např. Optiquant).
Jeden krok
Historicky byl proces sondování prováděn ve dvou krocích kvůli relativní snadnosti produkce primárních a sekundárních protilátek v oddělených procesech. To dává výzkumníkům a korporacím obrovské výhody z hlediska flexibility, snížení nákladů a přidává krok zesílení do detekčního procesu. Vzhledem k příchodu vysokovýkonné analýzy proteinů a nižších limitů detekce však existuje zájem o vývoj jednostupňových sondovacích systémů, které by umožnily proces proběhnout rychleji as menším množstvím spotřebního materiálu. To vyžaduje protilátku sondy, která rozpoznává požadovaný protein a obsahuje detekovatelné značky, sondy, které jsou často dostupné pro známé proteinové značky . Primární sonda se inkubuje s membránou podobným způsobem jako u primární protilátky ve dvoustupňovém procesu a poté je připravena k přímé detekci po sérii promývacích kroků.
Detekce a vizualizace
Poté, co se nevázané sondy smyjí, je western blot připraven k detekci sond, které jsou značeny a navázány na požadovaný protein. V praxi to znamená, že ne všechny westerny odhalují protein pouze v jednom pásu v membráně. Aproximace velikosti se provádí porovnáním obarvených pásů s pruhy značkovače nebo žebříku naloženého během elektroforézy. Proces se běžně opakuje u strukturálního proteinu, jako je aktin nebo tubulin, který by se neměl mezi vzorky měnit. Množství cílového proteinu se normalizuje na strukturální protein, aby se kontrolovalo mezi skupinami. Vynikající strategií je normalizace celkového proteinu vizualizovaného trichlorethanolem nebo epicoccononem . Tato praxe zajišťuje korekci na množství celkového proteinu na membráně v případě chyb nebo neúplných přenosů. (viz normalizace western blot )
Kolorimetrická detekce
Kolorimetrická detekční metoda závisí na inkubaci westernového přenosu se substrátem, který reaguje s reportérovým enzymem (jako je peroxidáza ), který je vázán na sekundární protilátku. To převádí rozpustné barvivo na nerozpustnou formu jiné barvy, která se vysráží vedle enzymu a tím obarví membránu. Vývoj skvrny je pak zastaven odplavením rozpustného barviva. Hladiny bílkovin se hodnotí pomocí denzitometrie (jak intenzivní je skvrna) nebo spektrofotometrie .
Chemiluminiscenční detekce
Chemiluminiscenční detekční metody závisí na inkubaci westernového přenosu se substrátem, který bude luminiscenční, když je vystaven reportéru na sekundární protilátce. Světlo je pak detekováno CCD kamerami, které zachycují digitální obraz westernového přenosu nebo fotografického filmu. Použití filmu pro detekci western blot pomalu mizí kvůli nelinearitě obrazu (nepřesná kvantifikace). Obraz je analyzován denzitometrií, která vyhodnocuje relativní množství barvení proteinů a kvantifikuje výsledky z hlediska optické hustoty. Novější software umožňuje další analýzu dat, například analýzu molekulové hmotnosti, pokud jsou použity příslušné standardy.
Radioaktivní detekce
Radioaktivní štítky nevyžadují enzymatické substráty, ale umožňují umístění lékařského rentgenového filmu přímo proti westernovému přenosu, který se vyvíjí, když je vystaven štítku, a vytváří tmavé oblasti, které odpovídají požadovaným proteinovým pásmům (viz obrázek výše). Důležitost metod radioaktivních detekcí klesá kvůli jejich nebezpečnému záření, protože je velmi nákladné, zdravotní a bezpečnostní rizika jsou vysoká a ECL (vylepšená chemiluminiscence) představuje užitečnou alternativu.
Fluorescenční detekce
Fluorescenčně značená sonda je excitována světlem a emise excitace je poté detekována fotosenzorem, jako je CCD kamera vybavená příslušnými emisními filtry, které zachycují digitální obraz westernového přenosu a umožňují další analýzu dat, jako je analýza molekulové hmotnosti a kvantitativní western blot analýza. Fluorescence je považována za jednu z nejlepších metod kvantifikace, ale je méně citlivá než chemiluminiscence.
Sekundární sondování
Jeden hlavní rozdíl mezi nitrocelulózovými a PVDF membránami se týká schopnosti každé z nich podporovat "odizolování" protilátek a opětovné použití membrány pro následné protilátkové sondy. I když jsou k dispozici dobře zavedené protokoly pro odstraňování nitrocelulózových membrán, odolnější PVDF umožňuje snazší odizolování a větší opakované použití před experimenty omezujícími hluk pozadí. Dalším rozdílem je, že na rozdíl od nitrocelulózy musí být PVDF před použitím namočen v 95% ethanolu, isopropanolu nebo methanolu. PVDF membrány také bývají silnější a odolnější vůči poškození během používání.
2-D gelová elektroforéza
Dvourozměrná stránka SDS-PAGE používá výše uvedené zásady a techniky. 2-D SDS-PAGE, jak název napovídá, zahrnuje migraci polypeptidů ve 2 rozměrech. Například v první dimenzi jsou polypeptidy separovány podle izoelektrického bodu , zatímco ve druhé dimenzi jsou polypeptidy separovány podle jejich molekulové hmotnosti . Izoelektrický bod daného proteinu je určen relativním počtem kladně (např. Lysinu, argininu) a záporně (např. Glutamátu, aspartátu) nabitých aminokyselin, přičemž záporně nabité aminokyseliny přispívají k nízkému izoelektrickému bodu a kladně nabité aminokyseliny přispívají do vysokého izoelektrického bodu. Vzorky by také mohly být nejprve separovány za neredukujících podmínek pomocí SDS-PAGE a za redukčních podmínek v druhé dimenzi, která rozkládá disulfidové vazby, které drží podjednotky pohromadě. SDS-PAGE může být také spojena s močovinou-PAGE pro 2-dimenzionální gel.
V zásadě tato metoda umožňuje separaci všech buněčných proteinů na jeden velký gel. Hlavní výhodou této metody je, že často rozlišuje různé izoformy konkrétního proteinu - např. Protein, který byl fosforylován (přidáním negativně nabité skupiny). Proteiny, které byly separovány, mohou být vyjmuty z gelu a poté analyzovány hmotnostní spektrometrií , která identifikuje jejich molekulovou hmotnost.
Viz také
Reference
externí odkazy
|
Knihovní zdroje o západním imunoblottingu |
- Yang, Ping-Chang; Mahmood, Tahrin (2012). „Western blot: Technika, teorie a řešení problémů“ . North American Journal of Medical Sciences . 4 (9): 429–434. doi : 10.4103/1947-2714.100998 . ISSN 1947-2714 . PMC 3456489 . PMID 23050259 .
- „Western blotování“ . YouTube . Laboratoře Bio-Rad. 16. října 2012.
- „Techniky blotování/ Princip westernového blotování“ . YouTube . Biomedicínské a biologické vědy. 23. března 2017.