Kolonie tvořící jednotka - Colony-forming unit

Pro lidskou krvetvornou buňku viz Hematopoetická kmenová buňka .

Jednotka tvořících kolonie ( CFU, cfu, CFU ) je jednotka použita v mikrobiologii pro odhad počtu životaschopných bakterií nebo houbových buněk ve vzorku. Životaschopná je definována jako schopnost množit se binárním štěpením za kontrolovaných podmínek. Počítání s jednotkami tvořícími kolonie vyžaduje kultivaci mikrobů a počítá pouze životaschopné buňky, na rozdíl od mikroskopického vyšetření, které počítá všechny buňky, živé nebo mrtvé. Vizuální vzhled kolonie v buněčné kultuře vyžaduje výrazný růst a při počítání kolonií není jisté, zda kolonie pocházela z jedné buňky nebo skupiny buněk. Vyjádření výsledků jako jednotek tvořících kolonie odráží tuto nejistotu.

Teorie

Ředění provedené bakteriemi a peptonovanou vodou se umístí na agarovou destičku ( počet agarových destiček pro vzorky potravin nebo sójový agar Trypticase pro klinické vzorky) a rozloží se na plotnu převrácením podle zobrazeného vzoru.

Účelem počítání destiček je odhadnout počet přítomných buněk na základě jejich schopnosti vést ke vzniku kolonií za specifických podmínek živného média, teploty a času. Teoreticky může jedna životaschopná buňka způsobit replikaci kolonii . Osamělé buňky jsou však v přírodě výjimkou a progenitorem kolonie byla s největší pravděpodobností masa buněk uložených společně. Mnoho bakterií navíc roste v řetězcích (např. Streptococcus ) nebo shlucích (např. Staphylococcus ). Odhad mikrobiálních čísel pomocí CFU ve většině případů z těchto důvodů podhodnotí počet živých buněk přítomných ve vzorku. Důvodem je, že počítání CFU předpokládá, že každá kolonie je oddělená a založená jedinou životaschopnou mikrobiální buňkou.

Počet destiček je u E. coli lineární v rozmezí 30 až 300 CFU na Petriho misce standardní velikosti . Aby se zajistilo, že vzorek poskytne CFU v tomto rozmezí, vyžaduje zředění vzorku a nanesení několika ředění. Obvykle se používá desetinásobné ředění a série ředění se nanese na replikáty 2 nebo 3 ve zvoleném rozsahu ředění. Často se nanese 100 µl, ale použije se také větší množství až do 1 ml. Vyšší objemy pokovování prodlužují dobu schnutí, ale často nevedou k vyšší přesnosti, protože mohou být zapotřebí další kroky ředění. CFU/destička se odečte z destičky v lineárním rozsahu a poté se matematicky odvodí CFU/g (nebo CFU/ml) originálu, přičemž se zohlední množství naneseného množství a jeho ředicí faktor (např. CLSI VET01S ).

Roztok bakterií o neznámé koncentraci se často sériově ředí, aby se získala alespoň jedna destička s počitatelným počtem bakterií. Na tomto obrázku je deska "x10" vhodná pro počítání.

Výhodou této metody je, že různé mikrobiální druhy mohou vést ke vzniku kolonií, které jsou navzájem jasně odlišné, a to jak mikroskopicky, tak makroskopicky . Morfologie kolonií může být velmi užitečné při identifikaci mikroorganismu současnosti.

Předchozí porozumění mikroskopické anatomii organismu může poskytnout lepší pochopení toho, jak pozorovaný CFU/ml souvisí s počtem životaschopných buněk na mililitr. Alternativně je možné v některých případech snížit průměrný počet buněk na CFU vortexováním vzorku před provedením ředění. Mnoho mikroorganismů je však choulostivých a trpí snížením podílu buněk, které jsou životaschopné, pokud jsou umístěny ve víru.

Záznam protokolu

Koncentrace jednotek tvořících kolonie lze vyjádřit pomocí logaritmického zápisu, kde uvedená hodnota je základním logaritmem koncentrace. To umožňuje snížení log z dekontaminačního procesu , které mají být vypočítán jako jednoduchý odčítání.

Využití

Jednotky tvořící kolonie se používají ke kvantifikaci výsledků v mnoha mikrobiologických metodách pokovování a počítání, včetně:

  • Metoda Pour Plate, kde je vzorek suspendován v Petriho misce za použití roztaveného agaru ochlazeného na přibližně 40-45 ° C (těsně nad bodem tuhnutí, aby se minimalizovala tepelně indukovaná buněčná smrt). Poté, co živný agar ztuhne, se plotna inkubuje.
  • Metoda Spread Plate, při které je vzorek (v malém objemu) rozprostřen po povrchu plotny s živným agarem a před inkubací pro počítání se nechá uschnout.
  • Metoda membránového filtru, kde je vzorek filtrován přes membránový filtr, poté je filtr umístěn na povrch plotny s živným agarem (bakteriální stranou nahoru). Během inkubace se živiny vyluhují filtrem, aby podpořily rostoucí buňky. Protože povrchová plocha většiny filtrů je menší než povrch standardní Petriho misky, lineární rozsah počtu desek bude menší.
  • Metody podle Milese a Misry nebo metody s kapací destičkou, kde se velmi malý alikvot (obvykle asi 10 mikrolitrů) vzorku z každého ředění v sérii nakape na Petriho misku. Pokrmovou misku je třeba přečíst, dokud jsou kolonie velmi malé, aby se zabránilo ztrátě CFU, jak rostou společně.

Avšak s technikami, které vyžadují použití agarové plotny, nelze použít žádný tekutý roztok, protože čistotu vzorku nelze určit a není možné počítat buňky jeden po druhém v kapalině.

Nástroje pro počítání kolonií

Tradiční způsob výčtu CFU pomocí „počítadla kliknutí“ a pera. Když je kolonií příliš mnoho, je běžnou praxí počítat CFU pouze na zlomek misky.

Počítání kolonií se tradičně provádí ručně pomocí pera a počítadla kliknutí. To je obecně přímočarý úkol, ale může být velmi pracné a časově náročné, když je třeba vyjmenovat mnoho desek. Alternativně lze použít poloautomatické (softwarové) a automatické (hardwarové + softwarové) řešení.

Software pro počítání CFU

Kolonie lze vyčíslit z obrázků desek pomocí softwarových nástrojů. Experimentátoři by obecně vyfotili každou desku, kterou potřebují spočítat, a poté analyzovali všechny obrázky (lze to provést jednoduchým digitálním fotoaparátem nebo dokonce webovou kamerou). Protože pořízení jednoho obrázku zabere méně než 10 sekund, na rozdíl od několika minut pro ruční počítání CFU, tento přístup obecně ušetří spoustu času. Navíc je objektivnější a umožňuje extrakci dalších proměnných, jako je velikost a barva kolonií.

  • OpenCFU [1] je bezplatný a open-source program navržený tak, aby optimalizoval uživatelskou přívětivost, rychlost a robustnost. Nabízí širokou škálu filtrů a ovládání a také moderní uživatelské rozhraní. OpenCFU je napsán v C ++ a používá OpenCV pro analýzu obrazu.
  • NICE je program napsaný v MATLABu, který poskytuje snadný způsob počítání kolonií z obrázků.
  • ImageJ a CellProfiler : Některá makra a pluginy ImageJ a některé kanály CellProfiler lze použít k počítání kolonií. To často vyžaduje, aby uživatel změnil kód, aby dosáhl efektivního pracovního toku, ale může se ukázat jako užitečný a flexibilní. Jedním z hlavních problémů je absence konkrétního grafického uživatelského rozhraní, které může způsobit únavu interakce s algoritmy zpracování.

Kromě softwaru založeného na tradičních stolních počítačích jsou pro poloautomatické a automatické počítání kolonií k dispozici aplikace pro zařízení Android i iOS. Integrovaná kamera se používá k pořizování snímků agarové desky a ke zpracování obrazových dat a k odhadu počtu kolonií se používá interní nebo externí algoritmus.

Automatizované systémy

Mnoho automatizovaných systémů se používá k boji proti lidské chybě, protože mnoho výzkumných technik prováděných lidmi, kteří počítají jednotlivé buňky, má velkou šanci na chybu. Vzhledem k tomu, že vědci pravidelně ručně počítají buňky pomocí procházejícího světla, může tato technika náchylná k chybám mít významný vliv na vypočítanou koncentraci v hlavním kapalném médiu, když jsou buňky v nízkém počtu.

Automatický čítač kolonií využívající zpracování obrazu.

Od některých výrobců biotechnologií jsou k dispozici také plně automatizované systémy. Jsou obecně drahé a nejsou tak flexibilní jako samostatný software, protože hardware a software jsou navrženy tak, aby spolupracovaly při konkrétním nastavení. Alternativně některé automatické systémy používají paradigma spirálového pokovování .

Některé z automatizovaných systémů, jako jsou systémy od MATLAB, umožňují počítání buněk, aniž by bylo nutné je barvit. To umožňuje kolonie znovu použít pro jiné experimenty bez rizika usmrcení mikroorganismů skvrnami. Nevýhodou těchto automatizovaných systémů je však to, že je extrémně obtížné rozlišit mezi mikroorganismy prachem nebo škrábanci na destičkách krevního agaru, protože jak prach, tak škrábance mohou vytvářet velmi různorodou kombinaci tvarů a vzhledů.

Alternativní jednotky

Místo jednotek tvořících kolonie lze použít parametry Nejpravděpodobnější číslo (MPN) a Modifikované jednotky rybářů (MFU). Metoda nejpravděpodobnějšího počtu počítá životaschopné buňky a je užitečná při výčtu nízkých koncentrací buněk nebo výčtu mikrobů ve výrobcích, kde částice způsobují, že počítání desek je nepraktické. Modifikované jednotky Fishman berou v úvahu bakterie, které jsou životaschopné, ale nekultivovatelné.

Viz také

Reference

Další čtení