DnaG - DnaG

DnaG je bakteriální DNA primáza a je kódován genem dnaG . Enzym DnaG a jakákoli jiná DNA primáza syntetizuje během replikace DNA krátké řetězce RNA známé jako oligonukleotidy . Tyto oligonukleotidy jsou známé jako primery, protože fungují jako výchozí bod pro syntézu DNA. DnaG katalyzuje syntézu oligonukleotidů, které jsou dlouhé 10 až 60 nukleotidů (základní jednotka DNA a RNA), avšak většina syntetizovaných oligonukleotidů je 11 nukleotidů. Tyto RNA oligonukleotidy slouží jako primery nebo výchozí body pro syntézu DNA bakteriální DNA polymerázou III (Pol III). DnaG je důležitý při replikaci bakteriální DNA, protože DNA polymeráza nemůže zahájit syntézu řetězce DNA, ale může přidat nukleotidy pouze k již existujícímu řetězci. DnaG syntetizuje jeden RNA primer na počátku replikace . Tento primer slouží k přípravě syntézy DNA vedoucího řetězce . Pro druhé rodičovské vlákno, zaostávající vlákno , DnaG syntetizuje RNA primer každých několik kilobází (kb). Tyto primery slouží jako substráty pro syntézu fragmentů Okazaki .

V E. coli se DnaG sdružuje prostřednictvím nekovalentních interakcí s bakteriální replikativní helikázou DnaB k provádění své aktivity primázy, přičemž tři proteiny DnaG primázy se spojují s každou helikázou DnaB za vzniku primosomu . Primázy mají tendenci iniciovat syntézu na specifických třech nukleotidových sekvencích na šablonách s jednovláknovou DNA (ssDNA) a pro E. coli DnaG je sekvence 5'-CTG-3 '.

DnaG obsahuje tři oddělené proteinové domény : doménu vázající zinek, doménu RNA polymerázy a doménu vázající DnaB helikázu. Existuje několik bakterií, které používají DNA primázu DnaG. Několik organismů, které mají DnaG jako svou DNA primázu, jsou Escherichia coli ( E. coli ), Bacillus stearothermophilus a Mycobacterium tuberculosis (MTB). E. coli DnaG má molekulovou hmotnost 60 kilodaltonů (kDa) a obsahuje 581 aminokyselin .

Funkce

DnaG (DNA primáza) je základní enzym zapojený do replikační vidlice DNA

Organický mechanismus syntézy oligonukleotidů ribonukleové kyseliny (RNA) ve směru 5 'až 3'

DnaG katalyzuje syntézu oligonukleotidů v pěti samostatných krocích: vazba templátu, vazba nukleosid trifosfát (NTP), iniciace, extenze za vzniku primeru a přenos primeru k DNA polymeráze III. DnaG provádí tuto katalýzu poblíž replikační vidlice, která je tvořena helikázou DnaB během replikace DNA. DnaG musí být v komplexu s DnaB, aby katalyzoval tvorbu oligonukleotidových primerů.

Mechanismus syntézy primeru primázami zahrnuje dvě vazebná místa NTP na proteinu primázy (DnaG). Před vazbou jakýchkoli NTP za vzniku RNA primeru se sekvence templátu ssDNA váže na DnaG. SsDNA obsahuje sekvenci rozpoznávání tří nukleotidů, která rekrutuje NTP na základě párování bází Watson-Crick . Po navázání DNA musí DnaG vázat dva NTP, aby vytvořil kvartérní komplex enzym-DNA-NTP-NTP. Michaelisova konstanta (km) pro NTP se liší v závislosti na primase a šablonách. Dvě místa vázající NTP na DnaG se označují jako místo zahájení a místo prodloužení. Iniciační místo je místo, na které se váže NTP, který má být inkorporován na 5 'konci primeru. Místo prodloužení váže NTP, který je přidán na 3 'konec primeru.

Jakmile jsou na primázu navázány dva nukleotidy, katalyzuje DnaG tvorbu dinukleotidu vytvořením fosfodiesterové vazby pomocí dehydratační syntézy mezi 3 'hydroxylovou skupinou nukleotidu v iniciačním místě a a-fosfátem nukleotidu v místě prodloužení. Tato reakce vede k dinukleotidu a rozbití vazby mezi α a β fosforem za uvolnění pyrofosfátu. Tato reakce je nevratná, protože vznikající pyrofosfát je hydrolyzován na dvě anorganické molekuly fosfátu enzymem anorganická pyrofosfatáza . Tato reakce syntézy dinukleotidů je stejná reakce jako jakýkoli jiný enzym, který katalyzuje tvorbu DNA nebo RNA ( DNA polymeráza , RNA polymeráza ), proto musí DnaG vždy syntetizovat oligonukleotidy ve směru 5 'až 3'. V E. coli začínají primery trifosfátadenin-guanin (pppAG) dinukleotid na 5 'konci.

Aby mohlo dojít k dalšímu prodloužení dinukleotidu, musí být oligonukleotid přemístěn tak, aby byl 3 'NTP přenesen z místa prodloužení do místa iniciace, což umožní dalšímu NTP, aby se navázal na místo prodloužení a připojil se k 3' hydroxylové skupině oligonukleotid. Jakmile byl z kroku prodloužení syntézy primeru syntetizován oligonukleotid vhodné délky, přenáší DnaG nově syntetizovaný primer do DNA polymerázy III, aby syntetizoval DNA vedoucí řetězec nebo Okazaki fragmenty pro zaostávající řetězec. Krok omezující rychlost syntézy primeru nastává po navázání NTP, ale před nebo během syntézy dinukleotidů.

Struktura

Primáza E. Coli DnaG je podle studií proteolýzy monomerní protein o 581 zbytcích se třemi funkčními doménami. Existuje N-koncová doména vázající zinek (zbytky 1-110), kde je iont zinku čtyřstěnně koordinován mezi jedním histidinovým a třemi cysteinovými zbytky, což hraje roli v rozpoznávání sekvenčně specifických vazebných míst pro DNA. Centrální doména (zbytky 111-433) zobrazuje aktivity RNA polymerázy a je místem syntézy primerů RNA. C-koncová doména (zbytky 434-581) je zodpovědná za nekovalentní vazbu DnaG na protein helikázy DnaB .

Doména vázající zinek

Vlevo: Struktura vazebné domény zinku Bacillus stearothermophilus se zachovanými hydrofobními a bazickými zbytky zobrazenými ve stříbře. Vpravo: Zvětšený obrázek vazebného místa pro zinek zobrazující Cys40, Cys61, Cys64 a His43 koordinující iont zinku. Diagram vykreslený z PDB 1D0Q .

Doména vázající zinek, doména odpovědná za rozpoznávání sekvenčně specifických vazebných míst pro DNA, je konzervována ve všech virových, bakteriofágových, prokaryotických a eukaryotických DNA primázách. Doména vázající zinek primázy je součástí podrodiny domén vázajících zinek známých jako zinková páska . Domény zinkové pásky jsou charakterizovány dvěma β-vlásenkovými smyčkami, které tvoří doménu vázající zinek. Typicky se předpokládá, že doménám zinkové pásky chybí a-helixy , které je odlišují od ostatních domén vázajících zinek. V roce 2000 však byla doména vázající zinek DnaG krystalizována z Bacillus stearothermophilus, což odhalilo, že doména sestávala z pětivláknové antiparalelní β fólie sousedící se čtyřmi a šroubovicemi a 3 ₁₀ šroubovice na c-terminálním konci domény.

Místo vázání zinku B. stearothermophilus se skládá ze tří cysteinových zbytků, Cys40, Cys61 a Cys64, a jednoho histidinového zbytku, His43. Cys40 a His43 jsou umístěny na β-vlásence mezi druhou a třetí β vrstvou. Cys61 je umístěn na pátém β listu a Cys64 je na β-vlásence mezi čtvrtým a pátým β listem. Tyto čtyři zbytky koordinují iont zinku čtyřstěnně. Předpokládá se, že iont zinku stabilizuje smyčky mezi druhým a třetím β listem, stejně jako čtvrtým a pátým β listem. Doména je dále stabilizována řadou hydrofobních interakcí mezi hydrofobním vnitřním povrchem p listu, který je zabalen proti druhé a třetí a šroubovici. Vnější povrch β listu má také mnoho konzervovaných hydrofobních a bazických zbytků. Těmito zbytky jsou Lys30, Arg34, Lys46, Pro48, Lys56, Ile58, His60 a Phe62.

Vazba DNA

Předpokládá se, že funkcí domény vázající zinek je sekvenčně specifické rozpoznávání DNA. DNA primázy tvoří RNA primery, které se pak používají pro syntézu DNA. Umístění primerů RNA není náhodné, což naznačuje, že jsou umístěny na specifické sekvence DNA. Ve skutečnosti bylo prokázáno, že jiné DNA primázy rozpoznávají tripletové sekvence; specifická sekvence rozpoznávaná B. stearothermophilus dosud nebyla identifikována. Ukázalo se, že pokud jsou mutovány cystinové zbytky, které koordinují ionty zinku, DNA primáza přestane fungovat. To naznačuje, že doména vázající zinek hraje roli v rozpoznávání sekvencí. Kromě toho hydrofobní povrch p listu, stejně jako bazické zbytky, které jsou seskupeny primárně na jednom okraji listu, slouží k přilákání jednovláknové DNA, což dále usnadňuje vazbu DNA.

Na základě předchozích studií vazby DNA pomocí DNA primas se předpokládá, že se DNA váže na doménu vázající zinek přes povrch β listu, přičemž tři nukleotidy se váží přes tři řetězce β listu. Kladně nabité zbytky v archu by byly schopné navázat kontakty s fosfáty a aromatické zbytky by vytvářely stohovací interakce s bázemi. Toto je model vazby DNA ssDNA-vazebnou doménou replikačního proteinu A (RPA) . Je logické předpokládat, že doména vázající zinek B. stearothermophilus váže DNA podobným způsobem, protože zbytky důležité pro vazbu DNA v RPA se vyskytují ve strukturně ekvivalentních pozicích v B. stearothermophilus .

Doména RNA polymerázy

Struktura domény polymerázy DnaG RNA E. coli . Vysoce konzervované bazické zbytky Arg146, Arg221 a Lys229 jsou zobrazeny žlutě. Tento obrázek byl vykreslen z PDB 1DD9 .

Jak název napovídá, doména RNA polymerázy (RNAP) DnaG je zodpovědná za syntézu primerů RNA na jednořetězcové DNA. In-vivo je DnaG schopen syntetizovat fragmenty primeru až 60 nukleotidů, ale fragmenty primeru in vivo jsou omezeny na přibližně 11 nukleotidů. Během syntézy zaostávajícího řetězce syntetizuje DnaG mezi 2000 a 3000 primery rychlostí jednoho primeru za sekundu.

Doména RNAP DnaG má tři subdomény, N-koncovou doménu, která má smíšený α a β záhyb, centrální doménu skládající se z 5vláknového β listu a 6 α šroubovic a nakonec C-koncovou doménu, která je tvořena spirálovitý svazek sestávající z 3 antiparalelní α šroubovic. Centrální doména je tvořena v části toprim záhybu , záhybu, který byl pozorován v mnoha fosfotransferových proteinech vázajících kov. Centrální doména a N-terminální doména tvoří mělkou štěrbinu, která tvoří aktivní místo prodloužení řetězce RNA v DnaG. Otevření štěrbiny lemuje několik vysoce konzervovaných základních zbytků: Arg146, Arg221 a Lys229. Tyto zbytky jsou součástí elektrostaticky pozitivního hřebenu N-koncové subdomény. Je to tento hřeben, který interaguje s ssDNA a pomáhá jej vést do rozštěpu, který se skládá z kovového vazebného centra motivu toprim na centrální subdoméně a konzervovaných primasových motivů N-terminální domény. Kovové vazebné místo toprimové domény je místo, kde je syntetizován primer. Duplex RNA: DNA poté opouští další základní depresi.

Doména C-terminálu

Struktura vazebné domény helikázy E. Coli . Vykreslení z PDB 2R6A . Dolní dvě šroubovice tvoří spirálovitou vlásenku subdomény C2. Zbývajících pět šroubovic tvoří spirálovitý svazek subdomény C1.

Na rozdíl od obou domén vázajících zinek a domén RNA polymerázy nejsou C-koncové domény DNA primáz konzervovány. U prokaryotických primáz je jedinou známou funkcí této domény interakce s helikázou, DnaB. Tato doména se tedy nazývá doména vázající helikázu (HBD). HBD společnosti DnaG se skládá ze dvou subdomén: spirálového svazku , subdomény C1 a spirálového vlásenky, subdomény C2. Pro každou ze dvou až tří molekul DnaG, které se vážou na hexamer DnaB, interagují C1 subdomény HBD s DnaB v jeho N-koncových doménách na vnitřním povrchu hexamerového kruhu, zatímco C2 subdomény interagují s N-koncovými doménami na vnějším povrchu hexameru.

Bacillus stearothermophilus DnaG, modrý, v komplexu s hexamerickým DnaB, zelený. Vykreslení z PDB 2R6A

Byly identifikovány tři zbytky v B. stearothermophilus DnaB jako důležité pro tvorbu rozhraní DnaB, DnaG. Mezi tyto zbytky patří Tyr88, Ile119 a Ile125. Tyr88 je blízko v blízkosti, ale nedochází ke kontaktu s HBD společnosti DnaG. Mutace Tyr88 inhibuje tvorbu spirálového svazku DnaB na N-terminální doméně, přerušuje kontakty s HBD DnaG. Hexamerická struktura DnaB je skutečně trimer dimerů. Ile119 i Ile125 jsou pohřbeny v rozhraní dimeru N-terminální domény DnaB a mutace těchto zbytků inhibuje tvorbu hexamerní struktury a tedy interakci s DnaG. Jedním dalším zbytkem, který byl identifikován jako hrající klíčovou roli v interakci DnaB a DnaG, je Glu15. Mutace Glu15 nenarušuje tvorbu komplexu DnaB, DnaG, ale místo toho hraje roli při modulaci délky primerů syntetizovaných DnaG.

Inhibice DnaG

Analogy NTP, o kterých je známo, že inhibují DnaG i jiné enzymy polymerázy

Inhibitory DNA primas jsou cenné sloučeniny pro objasnění biochemických cest a klíčových interakcí, ale jsou také zajímavé jako sloučeniny vedoucí k vývoji léků proti bakteriálním chorobám. Většina sloučenin, o nichž je známo, že inhibují primázy, jsou nukleotidové analogy, jako je AraATP (viz Vidarabin ) a 2-fluor-AraATP. Tyto sloučeniny budou primázou často používány jako substráty, ale jakmile již dojde k syntéze nebo prodloužení, již nemůže dojít. Například E. coli DnaG použije jako substráty 2 ', 3'-dideoxynukleosid 5'-trifosfáty (ddNTP), které fungují jako terminátory řetězce kvůli nedostatku 3' hydroxylu za vzniku fosfodiesterové vazby s dalším nukleotidem.

Relativně malý počet inhibitorů primázy pravděpodobně odráží spíše inherentní obtížnost testů primázy než nedostatek potenciálních vazebných míst na enzymu. Krátká délka syntetizovaných produktů a obecně pomalá rychlost enzymu ve srovnání s jinými replikačními enzymy ztěžují vývoj přístupů vysoce výkonného screeningu (HTS). Navzdory obtížím existuje několik známých inhibitorů DnaG, které nejsou analogy NTP. Doxorubicin a suramin jsou oba DNA a NTP kompetitivní inhibitory Mycobacterium Tuberculosis DnaG. Je také známo, že suramin inhibuje eukaryotickou DNA primázu tím, že soutěží s GTP, takže je pravděpodobné, že suramin inhibuje DnaG podobným mechanismem.

externí odkazy

• dnaG + protein, + E + coli v americké lékařské knihovně (MeSH)
• DnaG + (Primase) v americké lékařské knihovně National Library of Medicine (MeSH)

Reference