Křižovatka Holliday - Holliday junction
.svg)
Holliday křižovatka je rozvětvený nukleová kyselina struktura, která obsahuje čtyři dvouvláknové ramena spojily. Tato ramena mohou přijmout jednu z několika konformací v závislosti na nárazníkové koncentracích soli a sekvenci z nukleobází nejbližších ke křižovatce. Struktura je pojmenována po Robinu Hollidayovi , molekulárním biologovi, který navrhl její existenci v roce 1964.
V biologii jsou Hollidayovy křižovatky klíčovým meziproduktem v mnoha typech genetické rekombinace , stejně jako při opravách přerušení dvou vláken . Tyto křižovatky mají obvykle symetrickou posloupnost a jsou tedy mobilní, což znamená, že čtyři jednotlivá ramena mohou klouzat křižovatkou ve specifickém vzoru, který do značné míry zachovává párování základen . V některých funkčních molekulách RNA se navíc objevují čtyřramenná spojení podobná Hollidayovým .
Imobilní Holliday křižovatky s asymetrickými sekvencemi, které uzamykají vlákna v konkrétní poloze, byly uměle vytvořeny vědci, aby studovali jejich strukturu jako model pro přirozené Holliday křižovatky. Tyto spoje také později našly použití jako základní strukturní stavební bloky v DNA nanotechnologii , kde lze více Hollidayových spojů kombinovat do specificky navržených geometrií, které poskytují molekulám vysoký stupeň strukturální tuhosti .
Struktura
Holliday křižovatky mohou existovat v různých konformačních izomerech s různými vzory koaxiálního skládání mezi čtyřmi dvojitými šroubovicovými rameny. Koaxiální stohování je tendence tupých konců nukleových kyselin se k sobě navzájem vázat interakcemi mezi exponovanými bázemi. Existují tři možné konformery: nestohovaný (nebo otevřený X) formulář a dva skládané formuláře. Neukládaná forma dominuje v nepřítomnosti dvojmocných kationtů, jako je Mg 2+ , kvůli elektrostatickému odpuzování mezi záporně nabitými páteři vláken. V přítomnosti alespoň asi 0,1 m M Mg 2+ je elektrostatické odpuzování potlačeno a převažují skládané struktury. V roce 2000 nebylo s jistotou známo, zda elektrostatické stínění bylo výsledkem místně specifické vazby kationtů na křižovatce, nebo přítomnosti difúzní kolekce iontů v roztoku.
Neukládaná forma je téměř čtvercová rovinná, rozšířená konformace. Na druhé straně skládané konformery mají dvě souvislé dvojšroubovicové domény oddělené úhlem asi 60 ° ve směru pro praváky . Dva ze čtyř pramenů zůstávají zhruba šroubovicové a zůstávají v každé ze dvou dvojitě šroubovicových domén, zatímco další dvě se protínají mezi těmito dvěma doménami antiparalelně .
Tyto dvě možné skládané formy se liší tím, že páry ramen jsou skládány navzájem; která z těchto dvou dominuje, je vysoce závislá na sekvencích bází nejblíže křižovatce. Některé sekvence vedou k rovnováze mezi dvěma konformery, zatímco jiné silně preferují jeden konformer. Zvláště se zdá, že spojení obsahující sekvenci A-CC přemosťující bod spojení silně preferují konformer, který umožňuje vytvoření vodíkové vazby mezi druhým cytosinem a jedním z fosfátů v bodě spojení. Zatímco většina studií se zaměřila na identity čtyř základen nejblíže ke křižovatce na každém rameni, je evidentní, že základny dále mimo mohou také ovlivnit pozorované konformace stohování.
Na křižovatkách se symetrickými sekvencemi je bod větve mobilní a může migrovat v procesu náhodného procházení . Rychlost migrace větví se dramaticky mění s koncentrací iontů, přičemž jednokrokové časy se zvyšují z 0,3-0,4 ms bez iontů na 270-300 ms s 10 mM Mg 2+ . Změna rychlosti je v korelaci s tvorbou skládaných versus neukládaných struktur.
Holliday křižovatky se zářezem , nebo zlom v jednom z pramenů, v místě spojení zaujímají kolmou orientaci, a vždy dávají přednost stohovacímu konformeru, který umístí zářez na zkřížený pramen spíše než na šroubovicový pramen.
Spoje RNA Holliday předpokládají antiparalelní skládanou konformaci při vysokých koncentracích hořčíku, kolmou skládanou konformaci při mírných koncentracích a rotují do paralelní skládané konformace při nízkých koncentracích, zatímco i malé koncentrace iontů vápníku upřednostňují antiparalelní konformer.
Biologická funkce
Spojení Holliday je klíčovým meziproduktem v homologní rekombinaci , biologickém procesu, který zvyšuje genetickou diverzitu přesunem genů mezi dvěma chromozomy , jakož i místně specifickými rekombinačními událostmi zahrnujícími integrázy . Dále se podílejí na opravách dvouvláknových zlomů . Kromě toho mohou vzniknout křížové struktury zahrnující Hollidayovy křižovatky, aby ulehčily šroubovicovému napětí v symetrických sekvencích v superšroubovicích DNA . Zatímco čtyřramenného křižovatky se objevují také v funkční RNA molekul, jako je U1 spliceosomal RNA a vlásenkové ribozymu na virus tabákové ringspot , tyto obvykle obsahují nepárové nukleotidů mezi párových dvojitě-helikální domény, a tedy nejsou zcela přijmout strukturu Holliday .
Spoje Holliday v homologní rekombinaci jsou mezi identickými nebo téměř identickými sekvencemi, což vede k symetrickému uspořádání sekvencí kolem centrální křižovatky. To umožňuje proces migrace větví, kde se vlákna pohybují přes spojovací bod. K odštěpení nebo vyřešení křižovatky Holliday může dojít dvěma způsoby. Štěpení původní sady vláken vede ke dvěma molekulám, které mohou vykazovat genovou konverzi, ale nikoli chromozomální crossover , zatímco štěpení druhé sady dvou řetězců způsobuje, že výsledné rekombinantní molekuly vykazují crossover. Všechny produkty, bez ohledu na štěpení, jsou heteroduplexy v oblasti migrace křižovatky Holliday.
Mnoho proteinů je schopno rozpoznat nebo narušit strukturu spojení Holliday. Jedna taková třída obsahuje enzymy řešící spojení, které štěpí spoje, někdy způsobem specifickým pro sekvenci. Takové proteiny narušují strukturu křižovatky různými způsoby, často tahají křižovatku do nezakryté konformace, rozbíjejí středové páry základen a/nebo mění úhly mezi čtyřmi rameny. Další třídy jsou větvící migrační proteiny, které zvyšují směnný kurz o řády, a místně specifické rekombinázy . V prokaryotech spadají resolvázy Hollidayových křižovatek do dvou rodin, integráz a nukleáz, které jsou si každý strukturně podobné, i když jejich sekvence nejsou konzervovány.
V eukaryotech, dvě primární modely pro homologní rekombinaci, jak opravy dvouřetězcové zlomy v DNA, jsou dvojité Přetrhové opravy (DSBR) dráhy (někdy nazývá dvojitý Holliday křižovatka modelu ) a syntéza závislé strand žíhání (SDSA) dráhy. V případě zlomení dvojitého vlákna je 3 'konec degradován a delší 5' konec napadá sousedící sesterský chromatid a vytváří replikační bublinu. Když se tato bublina blíží k rozbité DNA, delší 5 'antisense řetězec opět napadá smyslový řetězec této části DNA, přepisuje druhou kopii. Když replikace skončí, oba ocasy se znovu spojí a vytvoří se dvě Holliday Junctions, které se pak štěpí v různých vzorcích proteiny. Animaci tohoto procesu můžete vidět zde .
Dvouřetězcové zlomy DNA v bakteriích jsou opravovány cestou RecBCD homologní rekombinace. Přerušení, ke kterým dochází pouze na jednom ze dvou řetězců DNA, známých jako mezery v jednom řetězci, je považováno za opravené cestou RecF . Dráhy RecBCD i RecF zahrnují řadu reakcí známých jako migrace větví , při nichž dochází k výměně jednotlivých řetězců DNA mezi dvěma zkříženými molekulami duplexní DNA a rozlišení , při kterém jsou tyto dvě křížené molekuly DNA odříznuty a obnoveny do normálu dvouvláknový stav. K homologní rekombinaci dochází u několika skupin virů. U virů DNA, jako je herpesvirus , dochází k rekombinaci mechanismem rozpojení a opětovného připojení, jako u bakterií a eukaryot. U bakterií je migrace větví usnadněna komplexem RuvABC nebo proteinem RecG , molekulárními motory, které k pohybu křižovatky využívají energii hydrolýzy ATP . Spojení pak musí být vyřešeno na dva samostatné duplexy, přičemž se obnoví buď rodičovská konfigurace, nebo zkřížená konfigurace. Rozlišení může nastat buď horizontálně, nebo vertikálně během homologní rekombinace, čímž se získají patch produkty (pokud jsou ve stejné orientaci během opravy přetržení dvou vláken) nebo spojovací produkty (pokud jsou v jiné orientaci během opravy přetržení dvou vláken). RuvA a RuvB jsou proteiny migrace větví, zatímco RuvC je enzym řešící spojení.
Existují důkazy o rekombinaci u některých RNA virů , konkrétně virů ssRNA s pozitivním smyslem, jako jsou retroviry , pikornaviry a koronaviry . Existuje polemika o tom, zda k homologní rekombinaci dochází u negativních smyslů ssRNA virů, jako je chřipka .
Řešení
U pučících kvasinek Saccharomyces cerevisiae mohou být Hollidayovy křižovatky vyřešeny čtyřmi různými cestami, které představují v podstatě veškeré rozlišení Hollidayova spojení in vivo . Dráha, která produkuje většinu crossoverů v kvasinkách začínajících na S. cerevisiae a případně v savcích, zahrnuje proteiny EXO1 , MLH1 - MLH3 heterodimer (nazývaný MutL gamma) a SGS1 ( ortolog Bloom syndrom helikázy ). Heterodimer MLH1-MLH3 se přednostně váže na Holliday křižovatky. Jedná se o endonukleázu, která dělá jednovláknové zlomy v supervinuté dvouvláknové DNA. Heterodimer MLH1-MLH3 podporuje tvorbu zkřížených rekombinantů . Zatímco ostatní tři cesty, zahrnující proteiny MUS81 -MMS4, SLX1 a YEN1, v uvedeném pořadí, mohou podporovat rozlišení Hollidayova spojení in vivo, absence všech tří nukleáz má pouze mírný dopad na tvorbu zkřížených produktů.
Dvojité mutanty deletované pro MLH3 (hlavní dráha) i MMS4 (vedlejší cesta) vykazovaly dramaticky snížené křížení ve srovnání s divokým typem (6- až 17krát); životaschopnost spór však byla přiměřeně vysoká (62%) a chromozomální disjunkce se jevila většinou funkční.
Ačkoli je MUS81 součástí menší zkřížené cesty v meióze pučících kvasinek, rostlin a obratlovců, u prvoků Tetrahymena thermophila se MUS81 jeví jako součást zásadní, ne -li převládající zkřížené cesty. Dráha MUS81 se také jeví jako převládající zkřížená cesta ve štěpných kvasinkách Schizosaccharomyces pombe .
Tyto MSH4 a MSH5 proteiny tvoří strukturu hetero-oligomerní (heterodimer), v kvasinkách a lidí. V kvasinkách působí Saccharomyces cerevisiae MSH4 a MSH5 specificky k usnadnění křížení mezi homologními chromozomy během meiózy. Komplex MSH4/MSH5 váže a stabilizuje dvojité křižovatky Holliday a podporuje jejich rozlišení na crossover produkty. Hypomorfní (částečně funkční) mutant S. cerevisiae MSH4 vykázal 30% široké snížení genomu v počtu křížení a velký počet meióz s neměnnými chromozomy. Nicméně tento mutant vyvolal vzory životaschopnosti spor, což naznačuje, že k segregaci neměnných chromozomů dochází efektivně. U S. cerevisiae tedy správná segregace zjevně zcela nezávisí na křížení mezi homologními páry.
Využití v DNA nanotechnologiích
Nanotechnologie DNA je návrh a výroba umělých struktur nukleových kyselin jako technických materiálů pro nanotechnologie, nikoli jako nositelů genetických informací v živých buňkách. Pole používá rozvětvené struktury DNA jako základní součásti k vytváření složitějších, racionálně navržených struktur. Holliday křižovatky jsou tedy součástí mnoha takových struktur DNA. Protože izolované komplexy Hollidayových křižovatek jsou příliš flexibilní na to, aby se daly sestavit do velkých uspořádaných polí, strukturní motivy s více Hollidayovými křižovatkami se používají k vytvoření rigidních „ dlaždic “, které se pak mohou sestavit do větších „polí“.
Nejběžnějším takovým motivem je komplex dvojitého crossoveru (DX), který obsahuje dva Holliday křižovatky v těsné blízkosti sebe, což má za následek tuhou strukturu, která se může sama sestavit do větších polí. Struktura molekuly DX nutí Hollidayovy křižovatky přijmout konformaci s dvojitě šroubovicovými doménami přímo vedle sebe, na rozdíl od jejich preferovaného úhlu asi 60 °. Komplex může být navržen tak, aby přinutil křižovatky buď k paralelní nebo antiparalelní orientaci, ale v praxi se antiparalelní odrůda chová slušněji a paralelní verze se používá jen zřídka.
Strukturální motiv DX je základním stavebním kamenem metody DNA origami , která se používá k vytváření větších dvoj- a trojrozměrných struktur libovolného tvaru. Namísto použití jednotlivých DX dlaždic je jeden dlouhý pramen lešení složen do požadovaného tvaru řadou krátkých sponkových vláken. Po sestavení je vlákno lešení spojité přes dvojšroubovicové domény, zatímco sponkové prameny se účastní spojení Holliday jako křížené prameny.
Byly prokázány některé typy dlaždic, které si zachovávají nativní úhel 60 ° křižovatky Holliday. Jedno takové pole používá dlaždice obsahující čtyři spoje Holliday v uspořádání rovnoběžníku. Tato struktura měla tu výhodu, že umožňovala přímý vizualizaci úhlu spojení pomocí mikroskopie atomové síly . K vytvoření periodických trojrozměrných polí pro použití v rentgenové krystalografii biomolekul byly použity dlaždice tří spojů Holliday trojúhelníkovým způsobem . Tyto struktury jsou pojmenovány pro svou podobnost se strukturními jednotkami založenými na principu tensegrity , který využívá prutů jak v tahu, tak v tlaku.
Dějiny
Robin Holliday navrhl strukturu spojení, která nyní nese jeho jméno, jako součást svého modelu homologní rekombinace v roce 1964, na základě svého výzkumu organizmů Ustilago maydis a Saccharomyces cerevisiae . Tento model poskytl molekulární mechanismus, který vysvětlil jak genovou konverzi, tak chromozomální crossover . Holliday si uvědomil, že navrhovaná cesta by vytvořila heteroduplexní segmenty DNA s neshodami bází mezi různými verzemi jednoho genu. Předpověděl, že buňka bude mít mechanismus pro opravu nesouladu, který byl později objeven. Před Hollidayovým modelem přijímaný model zahrnoval mechanismus výběru kopie, kde je nové vlákno syntetizováno přímo z částí různých rodičovských vláken.
V původním Hollidayově modelu pro homologní rekombinaci dochází k přerušení jednoho vlákna ve stejném bodě na jednom řetězci každé rodičovské DNA. Volné konce každého zlomeného vlákna pak migrují na druhou šroubovici DNA. Tam jsou invazní prameny spojeny s volnými konci, na které narazí, což má za následek křižovatku Holliday. Jak se každý křížený řetězec znovu připojí ke svému původnímu partnerskému řetězci, vytlačí před sebou původní komplementární vlákno. To způsobí migraci spojení Holliday a vytvoření segmentů heteroduplexu. V závislosti na tom, které vlákno bylo použito jako templát k opravě druhého, mohou čtyři buňky vzniklé z meiózy skončit se třemi kopiemi jedné alely a pouze jednou z druhé, místo normálních dvou z každé, vlastností známou jako konverze genu .
Hollidayův původní model předpokládal, že na obou chromozomech bude přítomna heteroduplexní DNA, ale experimentální údaje o kvasinkách to vyvrátily. Aktualizovaný model Matt Meselson a Charley Radding v roce 1975 představil myšlenku migrace větví. Další pozorování v osmdesátých letech vedla k návrhu alternativních mechanismů pro rekombinaci, jako je model dvouvláknového zlomu ( Jack Szostak , Frank Stahl a další) a model jednořetězcového žíhání. Za třetí, model žíhání vláken závislý na syntéze nezahrnoval Hollidayovy křižovatky.
První experimentální důkazy o struktuře Hollidayova křižovatky pocházely ze studií elektronové mikroskopie na konci 70. let 20. století, kde byla čtyřramenná struktura jasně viditelná na obrázcích plazmidové a bakteriofágové DNA. Později v 80. letech 20. století byly identifikovány enzymy zodpovědné za iniciaci vzniku a navázání Hollidayových křižovatek, přestože v roce 2004 zůstala identifikace rezolucí savčích Hollidayových křižovatek nepolapitelná (více viz výše v části „Řešení spojů Holliday“ nejnovější informace). V roce 1983, umělé Holliday spojovací molekuly byly nejprve konstruovány ze syntetických oligonukleotidů podle Nadrian Seeman , což přispívá k přímé studium jejich fyzikálních vlastností. Velká část rané analýzy struktury Hollidayovy křižovatky byla odvozena ze studií gelové elektroforézy , FRET a studií hydroxylových radikálů a nukleázy . V 90. letech 20. století jsou k dispozici krystalografické a nukleární kyselinové NMR metody a také nástroje pro výpočetní molekulární modelování .
Genetici zpočátku předpokládali, že spojení přijme spíše paralelní než antiparalelní konformaci, protože to by homologní duplexy umístilo do bližšího vzájemného souladu. Chemická analýza v 80. letech 20. století ukázala, že křižovatka ve skutečnosti upřednostňovala antiparalelní konformaci, což bylo zjištění, které bylo považováno za kontroverzní, a sám Robin Holliday zpočátku o zjištěních pochyboval. Antiparalelní struktura se později stala široce přijímanou díky rentgenovým krystalografickým údajům o molekulách in vitro , ačkoli v roce 2004 zůstaly důsledky pro strukturu in vivo nejasné, zejména struktura spojů je často pozměněna proteiny k ní navázanými.
Koncepční základ pro nanotechnologii DNA poprvé položil Nadrian Seeman na začátku 80. let minulého století. V té době byla známa řada přirozeně rozvětvených struktur DNA, včetně replikační vidlice DNA a mobilního Hollidayova křižovatky, ale Seemanovo chápání bylo takové, že nehybné spojení nukleových kyselin lze vytvořit správným navržením řetězcových sekvencí k odstranění symetrie v sestavené molekule, a že tyto nehybné křižovatky lze v zásadě kombinovat do tuhých krystalických mřížek. První teoretický dokument navrhující toto schéma byl publikován v roce 1982 a první experimentální demonstrace imobilní DNA křižovatky byla publikována následující rok. Seeman vyvinul rigidnější motiv dvojitého crossoveru (DX) , vhodný pro vytváření dvourozměrných mříží, který v roce 1998 předvedl on a Erik Winfree . V roce 2006 Paul Rothemund poprvé předvedl techniku DNA origami pro snadné a robustní vytváření skládaných struktur DNA libovolného tvaru. Tato metoda umožnila vytvoření mnohem větších struktur, než bylo dříve možné, a jejichž navrhování a syntéza je méně technicky náročná. Syntézu trojrozměrné mřížky Seeman nakonec publikoval v roce 2009, téměř třicet let poté, co se ho rozhodl dosáhnout.
Reference
externí odkazy
- Holliday+křižovatky v USA Národní knihovna lékařských lékařských oborových nadpisů (MeSH)
- Konformační změna křižovatky Holliday
- Analýza aktivit migrace větví proteinů pomocí syntetických substrátů DNA (protokol)