Kultura rostlinné tkáně - Plant tissue culture

Kultura rostlinné tkáně je souborem technik používaných k udržování nebo pěstování rostlinných buněk, tkání nebo orgánů za sterilních podmínek na živném kultivačním médiu známého složení. Je široce používán k produkci klonů rostliny metodou známou jako mikropropagace . Různé techniky v rostlinné tkáňové kultuře mohou nabídnout určité výhody oproti tradičním způsobům propagace, včetně:

  • Produkce přesných kopií rostlin, které produkují obzvláště dobré květiny, plody nebo mají jiné žádoucí vlastnosti.
  • Rychlá produkce dospělých rostlin.
  • Produkce násobků rostlin bez semen nebo opylovačů nezbytných k produkci semen.
  • Regenerace celých rostlin z rostlinných buněk, které byly geneticky modifikovány.
  • Produkce rostlin ve sterilních kontejnerech, která jim umožňuje přesun, s výrazně sníženou šancí na přenos chorob, škůdců a patogenů.
  • Produkce rostlin ze semen, která mají jinak velmi nízkou šanci na klíčení a růst, tj. Orchideje a Nepenthes .
  • Čištění konkrétních rostlin od virových a jiných infekcí a rychlé rozmnožování těchto rostlin jako „vyčištěných zásob“ pro zahradnictví a zemědělství.

Kultura rostlinné tkáně se spoléhá na skutečnost, že mnoho rostlinných buněk má schopnost regenerovat celou rostlinu ( buněčná totipotence ). Jednotlivé buňky, rostlinné buňky bez buněčných stěn ( protoplasty ), kousky listů, stonků nebo kořenů lze často použít ke generování nové rostliny na kultivačním médiu s ohledem na požadované živiny a rostlinné hormony .

Techniky používané pro kultivaci rostlinné tkáně in vitro

Příprava rostlinné tkáně pro tkáňovou kulturu se provádí za aseptických podmínek za použití filtrovaného vzduchu HEPA poskytovaného laminárním průtokovým boxem . Poté se tkáň pěstuje ve sterilních nádobách, jako jsou Petriho misky nebo baňky, v růstové místnosti s řízenou teplotou a intenzitou světla. Živé rostlinné materiály z prostředí jsou přirozeně kontaminovány na svých površích (a někdy i v interiérech) mikroorganismy , takže jejich povrchy jsou sterilizovány v chemických roztocích (obvykle v alkoholu a chlornanu sodném nebo vápenatém ) před odebráním vhodných vzorků (známých jako explantáty ). Sterilní explantáty se potom obvykle umístí na povrch sterilního pevného kultivačního média, ale někdy se umístí přímo do sterilního kapalného média, zvláště když jsou požadovány kultury buněčné suspenze. Pevná a kapalná média se obvykle skládají z anorganických solí a několika organických živin, vitamínů a rostlinných hormonů. Pevná média se připravují z kapalných médií s přídavkem gelovacího činidla, obvykle purifikovaného agaru.

In vitro tkáňová kultura bramborových explantátů

Složení média, zejména rostlinných hormonů a zdroje dusíku (dusičnany versus amonné soli nebo aminokyseliny) mají zásadní vliv na morfologii tkání, které vyrůstají z původního explantátu. Například nadbytek auxinu často vede k množení kořenů, zatímco nadbytek cytokininu může vést k výhonkům . Rovnováha auxinu a cytokininu často způsobí neorganizovaný růst buněk nebo kalus , ale morfologie růstu bude záviset na druhu rostliny a na složení média. Jak kultury rostou, kusy se typicky odřezávají a subkultivují na nové médium, aby se umožnil růst nebo změnila morfologie kultury. Zručnost a zkušenosti tkáňového kultivátora jsou důležité při posuzování toho, které kousky kultivovat a které vyřadit.

Když výhonky vzejdou z kultury, mohou být odříznuty a zakořeněny auxinem za vzniku rostlin, které, když jsou zralé, mohou být přeneseny do zalévací půdy pro další růst ve skleníku jako normální rostliny.

Dráhy regenerace

Rostlinné tkáňové kultury pěstované v USDA semenné bance, Národním centru pro zachování genetických zdrojů.

Specifické rozdíly v regeneračním potenciálu různých orgánů a explantátů mají různá vysvětlení. Mezi významné faktory patří rozdíly ve stádiu buněk v buněčném cyklu , dostupnost nebo schopnost transportovat endogenní regulátory růstu a metabolické schopnosti buněk. Nejčastěji používanými tkáňovými explantáty jsou meristematické konce rostlin, jako je konec stonku, špička axilárního pupenu a kořen. Tyto tkáně mají vysokou míru buněčného dělení a buď se koncentrují, nebo produkují požadované látky regulující růst, včetně auxinů a cytokininů.

Účinnost regenerace výhonků v tkáňové kultuře je obvykle kvantitativní znak, který se často liší mezi druhy rostlin a v rámci rostlinného druhu mezi poddruhy, odrůdami, kultivary nebo ekotypy . Regenerace tkáňové kultury se proto může zkomplikovat, zvláště když je třeba vyvinout mnoho regeneračních postupů pro různé genotypy v rámci stejného druhu.

Tři běžné cesty regenerace rostlinné tkáňové kultury jsou propagace z již existujících meristémů (výhonková kultura nebo nodální kultura), organogeneze a ne-zygotická embryogeneze .

Propagace výhonků nebo uzlových segmentů se obvykle provádí ve čtyřech fázích pro hromadnou produkci sazenic in vitro vegetativním množením, ale organogeneze je běžnou metodou mikropropagace, která zahrnuje regeneraci tkání adventních orgánů nebo axilárních pupenů přímo nebo nepřímo z explantátů. Neygotická embryogeneze je pozoruhodná vývojová cesta, která je vysoce srovnatelná se zygotickými embryi, a je důležitou cestou pro produkci somaklonálních variant, vývoj umělých semen a syntézu metabolitů. Vzhledem k jednobuněčnému původu ne-zygotních embryí jsou upřednostňovány v několika regeneračních systémech pro mikropropagaci, manipulaci ploidy, přenos genů a produkci syntetických semen. Nicméně regenerace tkáně prostřednictvím organogeneze se také ukázala jako výhodná pro studium regulačních mechanismů vývoje rostlin.

Volba explantátu

Tkáň získaná z rostliny určené ke kultivaci se nazývá explantát.

Explantáty mohou být odebrány z mnoha různých částí rostliny, včetně částí výhonků, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých nediferencovaných buněk a z mnoha typů zralých buněk za předpokladu, že stále obsahují živou cytoplazmu a jádra a jsou schopny diferencovat a obnovit buněčné dělení. To dalo vzniknout konceptu totipotence rostlinných buněk. To však neplatí pro všechny buňky nebo pro všechny rostliny. U mnoha druhů se explantáty různých orgánů liší rychlostí růstu a regenerace, zatímco některé nerostou vůbec. Volba explantátového materiálu také určuje, zda jsou rostlinky vyvinuté prostřednictvím tkáňové kultury haploidní nebo diploidní . Také riziko mikrobiální kontaminace se zvyšuje nevhodnými explantáty.

První metoda zahrnující meristémy a indukci více výhonků je preferovanou metodou pro mikropropagační průmysl, protože rizika somaklonální variace (genetické variace indukované v tkáňové kultuře) jsou minimální ve srovnání s ostatními dvěma metodami. Somatická embryogeneze je metoda, která má potenciál být několikanásobně vyšší v násobení a je přístupná manipulaci v systémech kapalných kultur, jako jsou bioreaktory.

Některá explantáty, jako kořenový hrot , se obtížně izolují a jsou kontaminována půdní mikroflórou, která se během procesu tkáňové kultury stává problematickou. Určitá půdní mikroflóra může vytvářet těsné asociace s kořenovými systémy nebo dokonce růst uvnitř kořene. Částice půdy vázané na kořeny je obtížné odstranit bez poškození kořenů, které pak umožňuje mikrobiální útok. Tato přidružená mikroflóra obecně přeroste médium tkáňové kultury dříve, než dojde k významnému růstu rostlinné tkáně.

Některé kultivované tkáně rostou pomalu. Pro ně by existovaly dvě možnosti: (i) Optimalizace kultivačního média; ii) Kultivace vysoce citlivých tkání nebo odrůd. Nekróza může zkazit kultivované tkáně. Obecně se odrůdy rostlin liší náchylností k nekróze tkáňových kultur. Pěstováním vysoce citlivých odrůd (nebo tkání) je tedy možné ji řídit.

Anténa (nad půdou) je také bohatá na nežádoucí mikroflóru. Lze je však snadněji odstranit z explantátu jemným opláchnutím a zbytek lze obvykle usmrtit povrchovou sterilizací. Většina povrchové mikroflóry nevytváří těsné asociace s rostlinnou pletivou . Takové asociace lze obvykle nalézt vizuální kontrolou jako mozaika, odbarvení nebo lokalizovaná nekróza na povrchu explantátu.

Alternativou pro získání nekontaminovaných explantátů je odebrání explantátů ze sazenic, které jsou asepticky pěstovány ze semen sterilizovaných na povrchu. Tvrdý povrch osiva je méně propustný pro pronikání drsných povrchových sterilizačních činidel, jako je chlornan , takže přijatelné podmínky sterilizace použité pro semena mohou být mnohem přísnější než pro vegetativní tkáně.

Tkáňové kultivované rostliny jsou klony . Pokud je původní mateřská rostlina použitá k produkci prvních explantátů náchylná k patogenu nebo podmínkám prostředí, byla by ke stejnému problému náchylná celá plodina. Naopak všechny pozitivní vlastnosti by také zůstaly v rámci linie.

Aplikace tkáňové kultury rostlin

Kultura rostlinné tkáně se široce používá v rostlinných vědách, lesnictví a v zahradnictví. Aplikace zahrnují:

  • Komerční produkce rostlin používaných jako zalévání, krajina a květinářství, která využívá meristému a výhonkové kultury k produkci velkého počtu identických jedinců.
  • K zachování vzácných nebo ohrožených druhů rostlin.
  • Šlechtitelů rostlin může použít tkáňové kultury na obrazovce buněk, spíše než pro rostliny výhodných znaků, například herbicid odporu / tolerance.
  • Velký růst rostlinných buněk v kapalné kultuře v bioreaktorech pro produkci cenných sloučenin, jako jsou sekundární metabolity odvozené z rostlin a rekombinantní proteiny používané jako biofarmaka .
  • Křížení vzdáleně příbuzných druhů fúzí protoplastů a regenerací nového hybridu .
  • Rychle studovat molekulární základ pro fyziologické, biochemické a reprodukční mechanismy v rostlinách, například výběr in vitro pro rostliny odolné vůči stresu.
  • K křížovému opylování vzdáleně příbuzných druhů a poté tkáňové kultuře vzniklé embryo, které by jinak normálně zemřelo (Embryo Rescue).
  • Pro zdvojnásobení chromozomů a indukci polyploidie , například zdvojené haploidy, tetraploidy a další formy polyploidů . Toho je obvykle dosaženo aplikací antimitotických látek, jako je kolchicin nebo oryzalin .
  • Jako tkáň pro transformaci, po které následuje buď krátkodobé testování genetických konstruktů, nebo regenerace transgenních rostlin.
  • Určité techniky, jako je kultura meristémového hrotu, mohou být použity k výrobě čistého rostlinného materiálu z virulovaného materiálu, jako je cukrová třtina, brambory a mnoho druhů měkkého ovoce.
  • Lze získat produkci identických sterilních hybridních druhů.
  • Velkovýroba umělých semen prostřednictvím somatické embryogeneze

Laboratoře

Ačkoli někteří pěstitelé a školky mají vlastní laboratoře pro rozmnožování rostlin technikou tkáňové kultury, řada nezávislých laboratoří poskytuje vlastní propagační služby. Výměna informací o rostlinné tkáňové kultuře uvádí mnoho komerčních laboratoří tkáňových kultur. Vzhledem k tomu, že tkáňová kultura rostlin je velmi pracný proces, byl by to důležitý faktor při určování, které rostliny by byly komerčně životaschopné šířit v laboratoři.

Viz také

Reference

Poznámky

Prameny