Spektrofotometrie - Spectrophotometry

Stolní spektrofotometr

Spektrofotometr Beckman IR-1, ca. 1941

Spektrofotometr Beckman Model DB (model se dvěma paprsky), 1960

Ruční spektrofotometr používaný v grafickém průmyslu.

Spektrofotometrie je odvětví elektromagnetické spektroskopie zabývající se kvantitativním měřením odrazových nebo propustných vlastností materiálu jako funkce vlnové délky. Spektrofotometrie používá fotometry , známé jako spektrofotometry, které mohou měřit intenzitu světelného paprsku při různých vlnových délkách. Ačkoli se spektrofotometrie nejčastěji používá na ultrafialové, viditelné a infračervené záření, moderní spektrofotometry mohou vyslýchat široké spektrum elektromagnetického spektra , včetně rentgenových , ultrafialových , viditelných , infračervených a / nebo mikrovlnných vlnových délek.

Přehled

Spektrofotometrie je nástroj, který závisí na kvantitativní analýze molekul v závislosti na tom, kolik světla absorbují barevné sloučeniny. Důležitými vlastnostmi spektrofotometrů jsou spektrální šířka pásma (rozsah barev, které může přenášet testovaným vzorkem), procento přenosu vzorku, logaritmický rozsah absorpce vzorku a někdy i procento měření odrazivosti.

Spektrofotometr se běžně používá pro měření propustnosti nebo odrazivosti roztoků, průhledných nebo neprůhledných pevných látek, jako je leštěné sklo nebo plyny. Ačkoli je mnoho biochemikálií zabarveno, absorbuje viditelné světlo, a proto je lze měřit kolorimetrickými postupy, dokonce i bezbarvé biochemikálie lze často převést na barevné sloučeniny vhodné pro chromogenní reakce vytvářející barvu, čímž se získají sloučeniny vhodné pro kolorimetrickou analýzu. Mohou však být také navrženy pro měření difuzivity v kterémkoli z uvedených rozsahů světla, které obvykle pokrývají kolem 200 nm - 2500 nm pomocí různých ovládacích prvků a kalibrací . V rámci těchto rozsahů světla, jsou nutná kalibrace na zařízení pomocí standardů, které se liší v typu v závislosti na vlnové délce na fotometrickým stanovením .

Příkladem experimentu, ve kterém se používá spektrofotometrie, je stanovení rovnovážné konstanty roztoku. Určitá chemická reakce v roztoku může nastat v dopředném a zpětném směru, kde reaktanty tvoří produkty a produkty se rozpadají na reaktanty. V určitém okamžiku tato chemická reakce dosáhne rovnovážného bodu, který se nazývá rovnovážný bod. Za účelem stanovení příslušných koncentrací reaktantů a produktů v tomto bodě lze propustnost světla roztoku otestovat pomocí spektrofotometrie. Množství světla, které prochází roztokem, svědčí o koncentraci určitých chemikálií, které neumožňují průchod světla.

Absorpce světla je způsobena interakcí světla s elektronickým a vibračním režimem molekul. Každý typ molekuly má samostatnou sadu energetických úrovní spojených s tvorbou jejích chemických vazeb a jader, a tak bude absorbovat světlo specifických vlnových délek nebo energií, což vede k jedinečným spektrálním vlastnostem. To je založeno na jeho specifickém a odlišném makeupu.

Využívání spektrofotometrů zahrnuje různé vědecké obory, jako je fyzika , věda o materiálech , chemie , biochemie , chemické inženýrství a molekulární biologie . Jsou široce používány v mnoha průmyslových odvětvích, včetně polovodičů, laserové a optické výroby, tisku a forenzních zkoušek, stejně jako v laboratořích pro studium chemických látek. Spektrofotometrie se často používá při měření enzymových aktivit, stanovení koncentrací proteinů, stanovení enzymatických kinetických konstant a měření vazebných reakcí ligandů. Nakonec je spektrofotometr schopen určit, v závislosti na kontrole nebo kalibraci, jaké látky jsou přítomny v cíli a přesně kolik pomocí výpočtů pozorovaných vlnových délek.

V astronomii , termín spektrofotometrie odkazuje na měření spektra části nebeského objektu , ve kterém tok rozsah spektra je kalibrován jako funkci vlnové délky , obvykle ve srovnání s pozorováním spektrofotometrického standardní hvězdy, a koriguje na absorpci světla zemskou atmosférou.

Dějiny

Spektrofotometr, který vynalezl Arnold O. Beckman v roce 1940, byl vytvořen za pomoci jeho kolegů v jeho společnosti National Technical Laboratories založené v roce 1935, která se stala Beckman Instrument Company a nakonec Beckman Coulter . To by bylo řešením dříve vytvořených spektrofotometrů, které nebyly schopny správně absorbovat ultrafialové záření. Začal by vynálezem modelu A, kde byl k absorpci UV světla použit skleněný hranol. Zjistilo by se, že to neposkytlo uspokojivé výsledky, proto u modelu B došlo k posunu od sklenice k křemennému hranolu, což umožnilo lepší výsledky absorbance. Odtamtud se zrodil Model C s přizpůsobením rozlišení vlnové délky, které nakonec vyprodukovalo tři jednotky. Posledním a nejoblíbenějším modelem se stal Model D, který je nyní lépe známý jako DU spektrofotometr, který obsahoval skříň přístroje, vodíkovou lampu s ultrafialovým kontinuem a lepší monochromátor. Vyráběl se v letech 1941 až 1976, kde cena v roce 1941 činila 723 USD (za příplatek byla volitelná výbava pro vzdálené UV záření). Podle slov laureáta Nobelovy chemie Bruce Merrifielda to byl „pravděpodobně nejdůležitější nástroj, jaký byl kdy vyvinut pro rozvoj biologických věd“.

Jakmile byla v roce 1976 ukončena, společnost Hewlett-Packard vytvořila v roce 1979 první komerčně dostupný spektrofotometr s diodovým polem, známý jako HP 8450A. Spektrofotometry s diodovým polem se lišily od původního spektrofotometru vytvořeného Beckmanem, protože to byl první jednopaprskový mikroprocesorem řízený spektrofotometr, který skenoval několik vlnových délek najednou v sekundách. Ozařuje vzorek polychromatickým světlem, které vzorek absorbuje v závislosti na jeho vlastnostech. Poté se přenáší zpět mřížkou fotodiodového pole, které detekuje oblast vlnových délek spektra. Od té doby se tvorba a implementace spektrofotometrických zařízení nesmírně zvýšila a stala se jedním z nejinovativnějších nástrojů naší doby.

Design

Jednopaprskový skenovací spektrofotometr

Existují dvě hlavní třídy zařízení: jednopaprskový a dvojpaprskový. Spektrofotometr s dvojitým paprskem porovnává intenzitu světla mezi dvěma dráhami světla, přičemž jedna dráha obsahuje referenční vzorek a druhá zkušební vzorek. Jednopaprskový spektrofotometr měří relativní intenzitu světla svazku před a po vložení zkušebního vzorku. Ačkoli jsou srovnávací měření z dvojitých paprsků jednodušší a stabilnější, jednopaprskové nástroje mohou mít větší dynamický rozsah a jsou opticky jednodušší a kompaktnější. Některé speciální přístroje, jako jsou spektrofotometry zabudované do mikroskopů nebo teleskopů, jsou navíc kvůli praktičnosti jednopaprskovými nástroji.

Historicky spektrofotometry používají k výrobě analytického spektra monochromátor obsahující difrakční mřížku . Rošt může být pohyblivý nebo pevný. Pokud je použit jediný detektor, jako je fotonásobič nebo fotodioda , mřížku lze skenovat postupně (skenovací spektrofotometr), aby detektor mohl měřit intenzitu světla při každé vlnové délce (což bude odpovídat každému „kroku“). Lze také použít pole detektorů (maticový spektrofotometr), jako jsou nábojově vázaná zařízení (CCD) nebo fotodiodová pole (PDA). V takových systémech je mřížka pevná a intenzita každé vlnové délky světla se měří jiným detektorem v poli. Navíc většina moderních spektrofotometrů se středním infračerveným spektrem využívá k získání spektrální informace techniku Fourierovy transformace . Tato technika se nazývá infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací .

Při provádění měření propustnosti spektrofotometr kvantitativně porovnává zlomek světla, který prochází referenčním roztokem a testovacím roztokem, poté elektronicky porovná intenzitu dvou signálů a vypočítá procento přenosu vzorku ve srovnání s referenčním standardem. Pro měření odrazivosti spektrofotometr kvantitativně porovnává podíl světla, který se odráží od referenčních a zkušebních vzorků. Světlo ze zdrojové lampy prochází monochromátorem, který rozptyluje světlo do „duhy“ vlnových délek rotujícím hranolem a vydává úzké šířky pásma tohoto difrakčního spektra mechanickou štěrbinou na výstupní straně monochromátoru. Tyto šířky pásma jsou přenášeny testovacím vzorkem. Poté se měří hustota fotonového toku (obvykle wattů na metr na druhou) procházejícího nebo odraženého světla fotodiodou, zařízením vázaným na náboj nebo jiným světelným senzorem . Hodnota propustnosti nebo odrazivosti pro každou vlnovou délku zkušebního vzorku se poté porovná s hodnotami propustnosti nebo odrazivosti z referenčního vzorku. Většina přístrojů použije logaritmickou funkci k poměru lineární propustnosti pro výpočet „absorbance“ vzorku, což je hodnota úměrná „koncentraci“ měřené chemikálie.

Stručně řečeno, sled událostí ve skenovacím spektrofotometru je následující:

Světelný zdroj je osvětlen do monochromátoru, rozptylován do duhy a rozdělen na dva paprsky. Poté je naskenován přes vzorek a referenční řešení.
Frakce dopadajících vlnových délek jsou přenášeny nebo odráženy od vzorku a reference.
Výsledné světlo dopadá na fotodetektorové zařízení, které porovnává relativní intenzitu obou paprsků.
Elektronické obvody převádějí relativní proudy na procenta lineárního přenosu a / nebo hodnoty absorbance / koncentrace.

V poli spektrofotometru je sekvence následující:

Světelný zdroj se zazáří do vzorku a zaostří do štěrbiny
Procházející světlo je lomeno do duhy s odrazovou mřížkou
Výsledné světlo zasáhne fotodetektorové zařízení, které porovnává intenzitu paprsku
Elektronické obvody převádějí relativní proudy na procenta lineárního přenosu a / nebo hodnoty absorbance / koncentrace

Mnoho starších spektrofotometrů musí být kalibrováno postupem známým jako „nulování“, aby se vyvážil nulový proudový výstup dvou paprsků na detektoru. Přenos referenční látky je nastaven jako základní (základní) hodnota, takže přenos všech ostatních látek je zaznamenán ve vztahu k počáteční „vynulované“ látce. Spektrofotometr poté převede převodový poměr na „absorpční schopnost“, což je koncentrace specifických složek zkušebního vzorku vzhledem k původní látce.

Aplikace v biochemii

Spektrofotometrie je důležitá technika používaná v mnoha biochemických experimentech, které zahrnují izolaci DNA, RNA a proteinů, kinetiku enzymů a biochemické analýzy. Protože vzorky v těchto aplikacích nejsou snadno dostupné ve velkém množství, jsou obzvláště vhodné pro analýzu v této nedestruktivní technice. Vzácný vzorek lze navíc uložit pomocí platformy pro mikroobjemy, kde je pro kompletní analýzu zapotřebí jen 1 ul vzorku. Stručné vysvětlení postupu spektrofotometrie zahrnuje srovnání absorbance slepého vzorku, který neobsahuje barevnou sloučeninu, se vzorkem, který obsahuje barevnou sloučeninu. Toto zbarvení lze provést buď barvivem, jako je barvivo Coomasie Brilliant Blue G-250, měřeno při 595 nm, nebo enzymatickou reakcí, jak je patrné mezi β-galaktosidázou a ONPG (změní vzorek na žlutou), měřeno při 420 nm. Spektrofotometr se používá k měření barevných sloučenin ve viditelné oblasti světla (mezi 350 nm a 800 nm), lze jej tedy použít k vyhledání dalších informací o studované látce. V biochemických experimentech je zvolena chemická a / nebo fyzikální vlastnost a postup, který je použit, je specifický pro tuto vlastnost, aby bylo možné odvodit více informací o vzorku, jako je množství, čistota, aktivita enzymu atd. Lze použít spektrofotometrii pro řadu technik, jako je stanovení optimální absorbance vlnové délky vzorků, stanovení optimálního pH pro absorbance vzorků, stanovení koncentrací neznámých vzorků a stanovení pKa různých vzorků. Spektrofotometrie je také užitečným procesem pro čištění proteinů a lze ji také použít jako metodu pro vytvoření optických testů sloučeniny. Spektrofotometrická data lze také použít ve spojení s Beer-Lambertovou rovnicí za účelem stanovení různých vztahů mezi propustností a koncentrací a absorbancí a koncentrací. Protože spektrofotometr měří vlnovou délku sloučeniny prostřednictvím její barvy, lze přidat látku vázající barvivo, aby mohla projít změnou barvy a mohla být měřena. Je možné znát koncentrace dvousložkové směsi pomocí absorpčních spekter standardních roztoků každé složky. K tomu je nutné znát extinkční koeficient této směsi při dvou vlnových délkách a extinkční koeficienty roztoků, které obsahují známé hmotnosti těchto dvou složek. Spektrofotometry byly vyvíjeny a zdokonalovány po celá desetiletí a byly široce používány mezi chemiky. Spektrofotometry se navíc specializují na měření hodnot absorbance vlnové délky UV nebo viditelného světla. Je považován za vysoce přesný nástroj, který je také velmi citlivý, a proto extrémně přesný, zejména při určování změny barvy. Tato metoda je také vhodná pro použití v laboratorních experimentech, protože se jedná o levný a relativně jednoduchý proces. ${\ textstyle A = - \ log _ {10} T = \ epsilon cl = OD}$

UV viditelná spektrofotometrie

Většina spektrofotometrů se používá v UV a viditelných oblastech spektra a některé z těchto přístrojů také pracují v blízké infračervené oblasti. Koncentraci proteinu lze odhadnout měřením OD při 280 nm v důsledku přítomnosti tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu. Tato metoda není příliš přesná, protože složení proteinů se velmi liší a proteiny, které neobsahují žádnou z těchto aminokyselin, nemají maximální absorpci při 280 nm. Kontaminace nukleovými kyselinami může také interferovat. Tato metoda vyžaduje spektrofotometr schopný měřit v UV oblasti křemennými kyvetami.

Ultrafialově viditelná (UV-vis) spektroskopie zahrnuje energetické hladiny, které vzrušují elektronické přechody. Absorpce ultrafialového záření excituje molekuly, které jsou v základním stavu, do jejich excitovaného stavu.

Viditelná oblast 400–700 nm spektrofotometrie se hojně používá ve vědě kolorimetrie . Je známou skutečností, že funguje nejlépe v rozsahu 0,2–0,8 výrobců inkoustů OD, tiskařských společností, prodejců textilu a mnoha dalších, kteří potřebují data poskytovaná prostřednictvím kolorimetrie. Berou odečty v oblasti každých 5–20 nanometrů podél viditelné oblasti a vytvářejí křivku spektrální odrazivosti nebo datový proud pro alternativní prezentace. Tyto křivky lze použít k testování nové dávky barviva, aby se zkontrolovalo, zda odpovídá specifikacím, např. Tiskovým standardům ISO.

Tradiční viditelné oblasti spektrofotometrů nemohou detekovat, zda barvivo nebo základní materiál má fluorescenci. To může ztěžovat správu barevných problémů, pokud je například jeden nebo více tiskových inkoustů fluorescenčních. Pokud barvivo obsahuje fluorescenci, použije se bi-spektrální fluorescenční spektrofotometr . Existují dvě hlavní nastavení pro spektrofotometry vizuálního spektra, d / 8 (sférické) a 0/45. Názvy jsou dány geometrií světelného zdroje, pozorovatele a vnitřku měřicí komory. Vědci používají tento nástroj k měření množství sloučenin ve vzorku. Pokud je sloučenina koncentrovanější, vzorek absorbuje více světla; v malých rozmezích platí zákon Beer-Lambert a absorbance mezi vzorky se lineárně mění s koncentrací. V případě měření tisku se běžně používají dvě alternativní nastavení - bez / s UV filtrem pro lepší řízení efektu UV zjasňovačů v papírovém materiálu.

Mikroobjemový spektrofotometr METTLER TOLEDO UV5Nano

Vzorky se obvykle připravují v kyvetách ; v závislosti na oblasti zájmu mohou být konstruovány ze skla , plastu (oblast zájmu viditelného spektra) nebo z křemene (oblast zájmu vzdáleného UV spektra). Některé aplikace vyžadují měření malého objemu, které lze provádět na platformách pro mikroobjemy.

Aplikace

Odhad koncentrace rozpuštěného organického uhlíku
Specifická ultrafialová absorbance pro metriku aromaticity
Bialův test na koncentraci pentóz

Experimentální aplikace

Jak je popsáno v aplikační části, spektrofotometrii lze použít při kvalitativní i kvantitativní analýze DNA, RNA a proteinů. Lze použít kvalitativní analýzu a spektrofotometry se používají k záznamu spekter sloučenin skenováním oblastí širokých vlnových délek, aby se určily absorpční vlastnosti (intenzita barvy) sloučeniny při každé vlnové délce. Jedním experimentem, který může demonstrovat různá použití, která může mít viditelná spektrofotometrie, je separace β-galaktosidázy ze směsi různých proteinů. Spektrofotometrie se většinou nejlépe používá k vyčíslení množství čištění, kterým váš vzorek prošel, vzhledem k celkové koncentraci proteinu. Spuštěním afinitní chromatografie může být B-galaktosidáza izolována a testována reakcí shromážděných vzorků s ONPG a určením, zda vzorek zezelená. Po tomto testování může být vzorek purifikován kvantitativně při 420 nm pro specifickou interakci s ONPG a při 595 pro Bradfordův test. Kromě této spektrofotometrie lze použít tandem s dalšími technikami, jako je SDS-Page elektroforéza, k čištění a izolaci různých vzorků proteinů.

IR spektrofotometrie

Spektrofotometry určené pro infračervenou oblast jsou zcela odlišné kvůli technickým požadavkům na měření v této oblasti. Jedním z hlavních faktorů je typ fotosenzorů, které jsou k dispozici pro různé spektrální oblasti, ale infračervené měření je také náročné, protože prakticky vše vyzařuje IR světlo jako tepelné záření, zejména při vlnových délkách nad přibližně 5 μm.

Další komplikací je, že poměrně málo materiálů, jako je sklo a plast, absorbuje infračervené světlo, takže je nekompatibilní jako optické médium. Ideální optické materiály jsou soli , které silně neabsorbují. Vzorky pro IR spektrofotometrii mohou být roztřepeny mezi dvěma kotouči bromidu draselného nebo rozemlety bromidem draselným a lisovány do pelety. Pokud se mají měřit vodné roztoky, použije se pro konstrukci buňky nerozpustný chlorid stříbrný .

Spektroradiometry

Spektroradiometry , které fungují téměř jako spektrofotometry ve viditelné oblasti, jsou navrženy pro měření spektrální hustoty osvětlovacích látek. Aplikace mohou zahrnovat hodnocení a kategorizaci osvětlení pro prodej výrobcem nebo pro zákazníky, aby potvrdili, že lampa, kterou se rozhodli koupit, odpovídá jejich specifikacím. Součásti:

Languages

In other projects