Sledování virových neuronů - Viral neuronal tracing

Neuron PC12 infikovaný virem pseudorabies PRV GS443 (označen zeleně). Zelené tečky pohybující se od těla buňky ukazují anterográdní transport .

Virové neuronové trasování je použití viru ke sledování nervových drah , který poskytuje samo-replikující se stopovač . Viry mají výhodu vlastní replikace oproti molekulárním indikátorům, ale mohou se také šířit příliš rychle a způsobit degradaci nervové tkáně. Viry, které mohou infikovat nervový systém, nazývané neurotropní viry , se šíří prostorově blízkými sestavami neuronů prostřednictvím synapsí , což umožňuje jejich použití při studiu funkčně propojených neuronových sítí. Použití virů k označení funkčně spojených neuronů vyplývá z práce Alberta Sabina, který vyvinul biologický test, který by mohl posoudit infekci virů napříč neurony . Následný výzkum umožnil začlenění imunohistochemických technik k systematickému značení neuronálních spojení. K dnešnímu dni byly viry používány ke studiu více obvodů v nervovém systému.

Dějiny

Většina neuroanatomistů by souhlasila s tím, že pochopení toho, jak je mozek spojen se sebou samým a tělem, má prvořadý význam. Jako takový je stejně důležité mít způsob, jak vizualizovat a studovat spojení mezi neurony . Metody sledování neuronů nabízejí nebývalý pohled na morfologii a konektivitu neuronových sítí. V závislosti na použitém značkovači to může být omezeno na jeden neuron nebo může postupovat trans-synapticky na sousední neurony. Poté, co se indikátor dostatečně rozšíří, lze rozsah měřit buď fluorescencí (pro barviva) nebo imunohistochemií (pro biologické indikátory). Důležitou novinkou v této oblasti je použití neurotropních virů jako indikátorů. Ty se nejen šíří po počátečním místě infekce, ale mohou přeskočit synapse . Použití viru poskytuje samo-replikující se stopovací prvek. To může umožnit objasnění neurální mikroobvodu v rozsahu, který byl dříve nedosažitelný. To má významné důsledky pro skutečný svět. Pokud dokážeme lépe pochopit, které části mozku jsou úzce propojeny, můžeme předpovědět účinek lokalizovaného poranění mozku. Pokud má pacient například cévní mozkovou příhodu v amygdale , která je primárně zodpovědná za emoce , může mít také problém naučit se provádět určité úkoly, protože amygdala je vysoce propojena s orbitofrontální kůrou , která je zodpovědná za odměňování . Prvním krokem k vyřešení problému je jako vždy jeho úplné pochopení, takže pokud máme mít naději na nápravu poranění mozku, musíme nejprve porozumět jeho rozsahu a složitosti.

Životní cyklus viru

Životního cyklu virů, jako jsou například ty, které používají v neuronální sledování, se liší od buněčných organismů . Viry jsou parazitické povahy a nemohou se samy množit. Proto musí infikovat jiný organismus a účinně unést buněčné stroje, aby dokončili svůj životní cyklus. První fáze životního cyklu viru se nazývá vstup viru . To definuje způsob, jakým virus nakazí novou hostitelskou buňku. V přírodě se neurotropní viry obvykle přenášejí kousnutím nebo škrábanci, jako v případě viru vztekliny nebo určitých kmenů herpetických virů . Ve studiích trasování k tomuto kroku dochází uměle, obvykle pomocí injekční stříkačky. Další fáze životního cyklu viru se nazývá replikace viru . Během této fáze virus převezme strojní zařízení hostitelské buňky, aby buňka vytvořila více virových proteinů a shromáždila více virů. Jakmile buňka produkuje dostatečný počet virů, virus vstoupí do fáze vylučování viru . Během této fáze viry opouštějí původní hostitelskou buňku při hledání nového hostitele. V případě neurotropních virů k tomuto přenosu obvykle dochází v synapse . Viry mohou přeskakovat relativně krátký prostor z jednoho neuronu na druhý. Tato vlastnost je to, co dělá viry tak užitečné ve studiích sledovačů. Jakmile virus vstoupí do další buňky, cyklus začíná znovu. Původní hostitelská buňka se začne rozpadat po fázi vylučování. Ve sledovacích studiích je to důvod, proč musí být načasování přísně kontrolováno. Pokud se virus nechá šířit příliš daleko, původní mikroobvod, o který se jedná, je degradován a nelze získat žádné užitečné informace. Viry mohou typicky infikovat pouze malý počet organismů a dokonce i pouze určitý typ buněk v těle. Specifičnost konkrétního viru pro konkrétní tkáň je známá jako jeho tropismus . Viry ve sledovacích studiích jsou všechny neurotropní (schopné infikovat neurony).

Metody

Infekce

Virový indikátor může být zaveden do periferních orgánů, jako je sval nebo žláza . Některé viry, jako je adeno-asociovaný virus, mohou být injikovány do krevního oběhu a přes hematoencefalickou bariéru infikovat mozek. Může být také zaveden do ganglia nebo injikován přímo do mozku pomocí stereotaktického zařízení . Tyto metody nabízejí jedinečný pohled na to, jak jsou mozek a jeho periferie propojeny. Viry se zavádějí do neuronální tkáně mnoha různými způsoby. Existují dva hlavní způsoby, jak zavést stopovací látku do cílových tkání. Tlakové vstřikování vyžaduje, aby byl indikátor v kapalné formě vstřikován přímo do cely. Toto je nejběžnější metoda. Ionoforéza zahrnuje aplikaci proudu do značkovacího roztoku v elektrodě. Molekuly stopovače zachycují náboj a jsou vháněny do buňky prostřednictvím elektrického pole. Toto je užitečná metoda, pokud si přejete označit buňku po provedení techniky patch clamp . Jakmile je tracer zaveden do buňky, zmíněné transportní mechanismy převezmou kontrolu. Po zavedení do nervového systému začne virus infikovat buňky v místní oblasti. Viry fungují začleněním vlastního genetického materiálu do genomu infikovaných buněk. Hostitelská buňka pak bude produkovat proteiny kódované genem. Výzkumníci jsou schopni začlenit do infikovaných neuronů mnoho genů, včetně fluorescenčních proteinů používaných pro vizualizaci. Další pokroky v trasování neuronů umožňují cílenou expresi fluorescenčních proteinů specifickým buněčným typům.

Histologie a zobrazování

Jakmile se virus rozšíří do požadovaného rozsahu, mozek se rozřízne a připevní na podložní sklíčka. Poté jsou fluorescenční protilátky specifické pro virus nebo fluorescenční komplementární DNA sondy pro virovou DNA promyty přes řezy a zobrazeny pod fluorescenčním mikroskopem .

Směr přenosu

Viry lze přenášet jedním ze dvou směrů. Nejprve je třeba pochopit základní mechanismus axoplazmatického transportu . V axonu jsou dlouhé štíhlé proteinové komplexy nazývané mikrotubuly . Fungují jako cytoskelet, který pomáhá buňce udržovat její tvar. Ty mohou také působit jako dálnice v axonu a usnadňovat transport vezikul a enzymů naplněných neurotransmiterem tam a zpět mezi tělem buňky nebo somou a axonovým koncem nebo synapsí . Transport může probíhat v obou směrech: anterográdní (ze soma do synapse), nebo retrográdní (ze synapse do soma). Neurony těmito buněčnými cestami přirozeně transportují proteiny , neurotransmitery a další makromolekuly. Neuronální stopovače, včetně virů, využívají výhod těchto transportních mechanismů k distribuci indikátoru v celé buňce. Vědci to mohou použít ke studiu synaptických obvodů.

Anterográdní doprava

Anterográdní trasování je použití stopovače, který se pohybuje ze soma do synapse. Anterográdní transport využívá protein zvaný kinesin k pohybu virů podél axonu v anterográdním směru.

Retrográdní doprava

Retrográdní trasování je použití stopovače, který se přesouvá ze synapsí do soma. Retrográdní transport využívá protein zvaný dynein k pohybu virů podél axonu v retrográdním směru. Je důležité si uvědomit, že různé indikátory vykazují charakteristické afinity pro dynein a kinesin, a tak se budou šířit různými rychlostmi.

Duální doprava

Občas je žádoucí trasovat neurony proti proudu a po proudu, aby se určily jak vstupy, tak výstupy neurálních obvodů. To využívá kombinaci výše uvedených mechanismů.

Výhody a nevýhody

Použití virů jako indikátorů má své výhody a nevýhody. Jako takové existují některé aplikace, ve kterých jsou viry vynikajícím sledovatelem, a jiné aplikace, ve kterých existují lepší metody.

Výhody

Jednou z výhod používání virových stopovačů je schopnost viru přeskakovat synapsí. To umožňuje sledování mikroobvodů i projekčních studií. Několik molekulárních indikátorů to dokáže a ti, kteří mohou mít obvykle snížený signál v sekundárních neuronech. Proto je další výhodou sledování virů schopnost virů se replikovat. Jakmile je sekundární neuron infikován, virus se začne množit a replikovat. Jak se indikátor šíří mozkem, nedochází ke ztrátě signálu.

Nevýhody

Ačkoli některé charakteristiky virů přinášejí při sledování řadu výhod, jiné představují potenciální problémy. Viry, které se šíří nervovým systémem, infikují neurony a nakonec je zničí. Načasování stopovacích studií proto musí být přesné, aby umožnilo adekvátní šíření dříve, než dojde k neurální smrti. Viry mohou být škodlivé nejen pro nervovou tkáň, ale také pro tělo jako celek. Proto bylo obtížné najít viry, které by se k tomuto úkolu dokonale hodily. Virus používaný ke sledování by měl být v ideálním případě dostatečně infekční, aby poskytoval dobré výsledky, ale ne natolik, aby příliš rychle zničil nervovou tkáň nebo představoval zbytečná rizika pro exponované. Další nevýhodou je, že sledování virových neuronů v současné době vyžaduje další krok připojení fluorescenčních protilátek k virům pro vizualizaci dráhy. Naproti tomu většina molekulárních indikátorů je pestrobarevná a lze je prohlížet pouhým okem bez dalších úprav.

Aktuální využití

Virové trasování se používá především ke sledování neuronálních obvodů. Vědci používají jeden z výše uvedených virů ke studiu toho, jak jsou neurony v mozku navzájem propojeny s velmi jemnou úrovní detailů. Konektivita do značné míry určuje, jak funguje mozek. Viry byly použity mimo jiné ke studiu retinálních gangliových obvodů, kortikálních obvodů a spinálních obvodů.

Používané viry

Následuje seznam virů, které se v současné době používají pro účely sledování neuronů.

Reference