Syntéza DNA - DNA synthesis
Syntéza DNA je přirozené nebo umělé vytváření molekul deoxyribonukleové kyseliny (DNA). DNA je makromolekula tvořená nukleotidovými jednotkami, které jsou spojeny kovalentními vazbami a vodíkovými vazbami, v opakující se struktuře. K syntéze DNA dochází, když jsou tyto nukleotidové jednotky spojeny dohromady a vytvoří DNA; k tomu může dojít uměle ( in vitro ) nebo přirozeně ( in vivo ). Nukleotidové jednotky se skládají z dusíkaté báze (cytosin, guanin, adenin nebo thymin), pentózového cukru (deoxyribózy) a fosfátové skupiny. Každá jednotka je spojena, když se mezi její fosfátovou skupinou a pentózovým cukrem dalšího nukleotidu vytvoří kovalentní vazba, která vytvoří páteř cukr-fosfát. DNA je komplementární, dvouvláknová struktura, protože párování specifických bází (adenin a thymin, guanin a cytosin) se přirozeně vyskytuje, když se mezi nukleotidovými bázemi vytvoří vodíkové vazby.
Existuje několik různých definic pro syntézu DNA: může odkazovat na replikaci DNA - biosyntézu DNA ( amplifikace DNA in vivo ), polymerázovou řetězovou reakci - enzymatickou syntézu DNA ( in vitro amplifikace DNA) nebo genovou syntézu - fyzické vytváření umělých genových sekvencí . Ačkoli každý typ syntézy je velmi odlišný, sdílejí některé funkce. Nukleotidy, které byly spojeny za vzniku polynukleotidů, mohou působit jako templát DNA pro výskyt jedné formy syntézy DNA - PCR. Replikace DNA funguje také pomocí šablony DNA, dvojitá šroubovice DNA se během replikace odvíjí a vystavuje nepárové báze pro nové nukleotidy vodíkové vazbě. Genová syntéza však nevyžaduje DNA templát a geny jsou sestavovány de novo .
Syntéza DNA probíhá u všech eukaryot a prokaryot , stejně jako u některých virů . Přesná syntéza DNA je důležitá, aby se zabránilo mutacím na DNA. U lidí mohou mutace vést k chorobám, jako je rakovina, takže syntéza DNA a mechanismus zapojený in vivo byly po desetiletí rozsáhle studovány. V budoucnu mohou být tyto studie použity k vývoji technologií zahrnujících syntézu DNA, které budou použity při ukládání dat.
replikace DNA
V přírodě jsou molekuly DNA syntetizovány všemi živými buňkami procesem replikace DNA. K tomu obvykle dochází jako součást buněčného dělení. K replikaci DNA dochází, takže během dělení buněk každá dceřiná buňka obsahuje přesnou kopii genetického materiálu buňky. In vivo syntéza DNA (replikace DNA) je závislá na komplexním souboru enzymů, které se vyvinuly tak, aby jednaly koordinovaně během fáze S buněčného cyklu. V obou eukaryotes a prokaryotes, replikace DNA, dochází při specifických topoisomerázy, helikázy a gyrases (replikační iniciátor proteiny) rozvinout v dvouvláknové DNA, vystavením dusíkaté báze. Tyto enzymy spolu s pomocnými proteiny tvoří makromolekulární stroj, který zajišťuje přesnou duplikaci sekvencí DNA. Dochází ke komplementárnímu párování bází za vzniku nové dvouvláknové molekuly DNA. Toto je známé jako semi-konzervativní replikace, protože jedno vlákno nové molekuly DNA pochází z 'rodičovského' vlákna.
Eukaryotické enzymy se neustále setkávají s poškozením DNA, které může narušit replikaci DNA. Toto poškození je ve formě lézí DNA, které vznikají spontánně nebo v důsledku činidel poškozujících DNA. Zařízení pro replikaci DNA je proto vysoce kontrolováno, aby se předešlo kolapsu při poškození. Řízení systému replikace DNA zajišťuje, že genom je replikován pouze jednou za cyklus; nadměrná replikace indukuje poškození DNA. Deregulace replikace DNA je klíčovým faktorem genomové nestability během vývoje rakoviny.
To zdůrazňuje specifičnost strojů pro syntézu DNA in vivo . Existují různé prostředky k umělé stimulaci replikace přirozeně se vyskytující DNA nebo k vytváření umělých genových sekvencí. Syntéza DNA in vitro však může být velmi náchylný k chybám.
Syntéza opravy DNA
Poškozená DNA podléhá opravě několika různými enzymatickými opravnými procesy , kde je každý jednotlivý proces specializován na opravu konkrétních typů poškození. Lidská DNA podléhá poškození z více přírodních zdrojů a nedostatečná oprava je spojena s nemocemi a předčasným stárnutím . Většina procesů opravy DNA vytváří v mezilehlé fázi opravy jednovláknové mezery v DNA a tyto mezery jsou vyplněny opravnou syntézou. Procesy opravy specifické, které vyžadují vyplňování štěrbin syntézou DNA obsahují nukleotidové opravu vyříznutí , základní opravy vyříznutí , opravu chyby v párování , homologní rekombinační opravy, non-homologní konec spojovací a microhomology zprostředkované konec spojovací .
Reverzní přepis
Reverzní transkripce je součástí replikačního cyklu konkrétních virových rodin, včetně retrovirů . Zahrnuje kopírování RNA do dvouvláknové komplementární DNA (cDNA) pomocí enzymů reverzní transkriptázy . U retrovirů je virová RNA vložena do jádra hostitelské buňky. Virový enzym reverzní transkriptázy tam přidává DNA nukleotidy do sekvence RNA a vytváří cDNA, která je vložena do genomu hostitelské buňky enzymatickou integrázou , kódující virové proteiny.
Polymerázová řetězová reakce
Polymerázová řetězová reakce je forma enzymatické syntézy DNA v laboratoři za použití opakovaných cyklů zahřívání a chlazení reakce na DNA tavení a enzymatické replikaci DNA.
Syntéza DNA během PCR je velmi podobná živým buňkám, ale má velmi specifická činidla a podmínky. Během PCR se DNA chemicky extrahuje z hostitelských chaperonových proteinů a poté se zahřívá, což způsobuje tepelnou disociaci řetězců DNA. Z původního vlákna jsou vytvořena dvě nová vlákna cDNA, tato vlákna lze znovu rozdělit, aby fungovala jako templát pro další produkty PCR. Původní DNA se množí mnoha koly PCR. Lze vyrobit více než miliardu kopií původního řetězce DNA.
Náhodná mutageneze
Pro mnoho experimentů, jako jsou strukturální a evoluční studie, potřebují vědci vyrobit velkou knihovnu variant konkrétní sekvence DNA. Náhodná mutageneze probíhá in vitro, kdy je mutagenní replikace s DNA polymerázou s nízkou věrností kombinována se selektivní PCR amplifikací za vzniku mnoha kopií mutantní DNA.
RT-PCR
RT-PCR se liší od konvenční PCR, protože syntetizuje cDNA z mRNA, nikoli z templátové DNA. Tato technika spojuje reakci reverzní transkripce s amplifikací založenou na PCR, protože sekvence RNA funguje jako templát pro enzym, reverzní transkriptázu. RT-PCR se často používá k testování genové exprese v konkrétních typech tkání nebo buněk v různých vývojových stádiích nebo k testování genetických poruch.
Genová syntéza
Syntetická genová syntéza je proces syntetizace genu in vitro bez potřeby počátečních vzorků templátové DNA. V roce 2010 J. Craig Venter a jeho tým jako první použili zcela syntetizovanou DNA k vytvoření samoreplikujícího se mikroba, nazvaného Mycoplasma laboratorium .
Syntéza oligonukleotidů
Syntéza oligonukleotidů je chemická syntéza sekvencí nukleových kyselin. Většina biologického výzkumu a bioinženýrství zahrnuje syntetickou DNA, která může zahrnovat oligonukleotidy , syntetické geny nebo dokonce chromozomy . Dnes je veškerá syntetická DNA vyráběna na zakázku pomocí metody fosforamiditu od Marvina H. Carutherse . Oliga jsou syntetizována ze stavebních bloků, které replikují přírodní báze. Proces je automatizovaný od konce 70. let minulého století a lze jej použít k vytvoření požadovaných genetických sekvencí i pro další použití v medicíně a molekulární biologii. Chemické vytváření sekvencí je však nad 200-300 bází nepraktické a je to proces nebezpečný pro životní prostředí. Tato oliga, přibližně 200 bází, lze spojit pomocí metod sestavování DNA, čímž se vytvoří větší molekuly DNA.
Některé studie zkoumaly možnost enzymatické syntézy pomocí terminální deoxynukleotidyltransferázy (TdT), DNA polymerázy, která nevyžaduje žádnou šablonu. Tato metoda však ještě není tak účinná jako chemická syntéza a není komerčně dostupná.
S pokroky v umělé syntéze DNA se zkoumá možnost ukládání dat DNA . Díky extrémně vysoké hustotě ukládání a dlouhodobé stabilitě je syntetická DNA zajímavou možností pro ukládání velkého množství dat. Přestože informace lze z DNA získat velmi rychle pomocí technologií sekvenování nové generace, de novo syntéza DNA je hlavní překážkou tohoto procesu. Do jednoho cyklu lze přidat pouze jeden nukleotid, přičemž každý cyklus trvá několik sekund, takže celková syntéza je časově velmi náročná a náchylná k chybám. Pokud se však biotechnologie zlepší, syntetická DNA by mohla být jednoho dne použita při ukládání dat.
Syntéza párů bází
Bylo publikováno, že lze syntetizovat nové páry nukleobáz , stejně jako AT ( adenin - thymin ) a GC ( guanin - cytosin ). Syntetické nukleotidy lze použít k rozšíření genetické abecedy a umožnění specifické modifikace míst DNA. I pouhý třetí pár bází by rozšířil počet aminokyselin, které lze kódovat DNA ze stávajících 20 aminokyselin, na možných 172. DNA Hachimoji je postavena z osmi nukleotidových písmen a tvoří čtyři možné páry bází. Je tedy dvojnásobkem informační hustoty přirozené DNA. Ve studiích byla RNA dokonce vyrobena z DNA hachimoji. Tuto technologii lze také použít k umožnění ukládání dat v DNA.