Nukleosom - Nucleosome
Nucleosome je základní strukturní jednotka DNA balení v eukaryot . Struktura nukleosomu se skládá ze segmentu DNA navinutého kolem osmi histonových proteinů a připomíná nit omotanou kolem cívky. Nukleosom je základní podjednotkou chromatinu . Každý nukleozom se skládá z o něco méně než dvou závitů DNA obalených sadou osmi proteinů nazývaných histony, které jsou známé jako histonový oktamer . Každý histonový oktamer se skládá ze dvou kopií histonových proteinů H2A , H2B , H3 a H4 .
DNA musí být zhutněna do nukleosomů, aby se vešla do buněčného jádra . Kromě obalení nukleosomů je eukaryotický chromatin dále zhutňován skládáním do řady složitějších struktur, které nakonec tvoří chromozom . Každá lidská buňka obsahuje asi 30 milionů nukleosomů.
Předpokládá se, že nukleozomy nesou epigeneticky zděděné informace ve formě kovalentních modifikací jejich jádrových histonů . Pozice nukleosomů v genomu nejsou náhodné a je důležité vědět, kde se každý nukleozom nachází, protože to určuje přístupnost DNA k regulačním proteinům .
Nukleosomy byly poprvé pozorovány jako částice v elektronovém mikroskopu od Don a Ada Olins v roce 1974 a jejich existenci a strukturu (jako histonové oktamery obklopené přibližně 200 páry párů DNA) navrhl Roger Kornberg . Roli nukleosomu jako obecného genového represoru prokázali Lorch et al. in vitro, a Han a Grunstein in vivo v roce 1987, respektive 1988.
Částice jádra nukleozomu se skládá z přibližně 146 párů bází (bp) DNA obalené 1,67 levotočivých superhelikálních závitů kolem histonového oktameru, který se skládá ze 2 kopií každého z jádrových histonů H2A , H2B , H3 a H4 . Částice jádra jsou spojeny úseky linkerové DNA , které mohou být až asi 80 bp dlouhé. Technicky je nukleosom definován jako jádrová částice plus jedna z těchto spojovacích oblastí; slovo je však často synonymem pro jádrovou částici. Mapy polohování nukleosomů v celém genomu jsou nyní k dispozici pro mnoho modelových organismů včetně myších jater a mozku.
Linkerové histony, jako je H1 a jeho izoformy, se podílejí na zhutňování chromatinu a sedí na bázi nukleosomu poblíž vstupu a výstupu DNA vazby na oblast linkeru DNA. Nekondenzované nukleosomy bez histonového linkeru připomínají „kuličky na řetězci DNA“ pod elektronovým mikroskopem .
Na rozdíl od většiny eukaryotických buněk zralé spermie do značné míry používají k zabalení své genomové DNA protaminy , s největší pravděpodobností dosáhnou ještě vyššího poměru balení. V Archaea byly také nalezeny histonové ekvivalenty a zjednodušená struktura chromatinu , což naznačuje, že eukaryoty nejsou jediné organismy, které používají nukleosomy.
Struktura
Struktura částice jádra
Přehled
Průkopnické strukturální studie skupiny Aarona Klugga v osmdesátých letech poskytly první důkaz, že oktamer histonových proteinů obalí DNA kolem sebe asi o 1,7 otáčky levotočivého superhelixu. V roce 1997 byla Richmondovou skupinou vyřešena první krystalová struktura nukleozomu s téměř atomovým rozlišením , která ukázala nejdůležitější detaily částice. Lidská alfa satelitní palindromická DNA kritická pro dosažení struktury nukleosomových krystalů 1997 byla vyvinuta skupinou Bunick v Oak Ridge National Laboratory v Tennessee. Struktury více než 20 různých částic jádra nukleosomů byly dosud vyřešeny, včetně struktur obsahujících histonové varianty a histony z různých druhů. Struktura částice jádra nukleosomu je pozoruhodně konzervovaná a dokonce i změna více než 100 zbytků mezi žabími a kvasinkovými histony má za následek mapy elektronové hustoty s celkovou střední kvadratickou odchylkou pouze 1,6 Á.
Částice jádra nukleosomu (NCP)
Částice jádra nukleosomu (zobrazená na obrázku) se skládá z přibližně 146 párů bází DNA obalených 1,67 levotočivých superhelikálních závitů kolem histonového oktameru , skládajících se ze 2 kopií každého z jádrových histonů H2A , H2B , H3 a H4 . Sousední nukleosomy jsou spojeny úsekem volné DNA nazývané linkerová DNA (která se liší od 10 do 80 bp na délku v závislosti na druhu a typu tkáně). Celá struktura vytváří válec o průměru 11 nm a výšce 5,5 nm.
Částice jádra nukleozomu jsou pozorovány, když je chromatin v mezifázi ošetřen, aby způsobil částečné rozvinutí chromatinu. Výsledný obraz prostřednictvím elektronového mikroskopu je „korálky na provázku“. Řetězec je DNA, zatímco každá kulička v nukleosomu je jádrovou částicí. Částice jádra nukleosomu je složena z DNA a histonových proteinů.
Částečné DNAse digesce chromatinu odhaluje jeho nucleosome strukturu. Protože části DNA jaderných částic nukleosomu jsou pro DNAse hůře dostupné než spojovací úseky, DNA se štěpí na fragmenty o délkách rovných multiplicitě vzdálenosti mezi nukleosomy (180, 360, 540 párů bází atd.). Během gelové elektroforézy této DNA je tedy viditelný velmi charakteristický vzor podobný žebříku . Takové štěpení může nastat také za přirozených podmínek během apoptózy („buněčná sebevražda“ nebo programovaná buněčná smrt), protože její úlohou je typicky autodestrukce DNA .
Interakce proteinů v nukleosomu
Jádrové histonové proteiny obsahují charakteristický strukturní motiv nazývaný „histonový záhyb“, který se skládá ze tří alfa-šroubovic (α1-3) oddělených dvěma smyčkami (L1-2). V roztoku histony tvoří heterodimery H2A-H2B a heterotetramery H3-H4. Histony dimerizují o svých dlouhých a2 šroubovicích v antiparalelní orientaci a v případě H3 a H4 tvoří dva takové dimery svazek 4 šroubovice stabilizovaný rozsáhlou interakcí H3-H3 '. Dimer H2A/H2B se váže na tetramer H3/H4 v důsledku interakcí mezi H4 a H2B, které zahrnují tvorbu hydrofobního klastru. Histonový oktamer je tvořen centrálním tetramerem H3/H4 vloženým mezi dva dimery H2A/H2B. Vzhledem k vysoce zásaditému náboji všech čtyř jádrových histonů je histonový oktamer stabilní pouze za přítomnosti DNA nebo velmi vysokých koncentrací solí.
Interakce histonu a DNA
Nukleosom obsahuje více než 120 přímých interakcí protein-DNA a několik stovek zprostředkovaných vodou. Přímé interakce protein - DNA nejsou rozloženy rovnoměrně po povrchu oktameru, ale jsou spíše umístěny na diskrétních místech. Jsou způsobeny tvorbou dvou typů vazebných míst DNA v oktameru; místo α1α1, které využívá šroubovici α1 ze dvou sousedních histonů, a místo L1L2 tvořené smyčkami L1 a L2. Solné vazby a vodíkové vazby mezi bazickými a hydroxylovými skupinami postranního řetězce a amidy hlavního řetězce s fosfáty DNA hlavního řetězce tvoří většinu interakcí s DNA. To je důležité, vzhledem k tomu, že všudypřítomná distribuce nukleosomů podél genomů vyžaduje, aby se jednalo o nesekvenčně specifický faktor vázající DNA. Ačkoli nukleosomy mají tendenci upřednostňovat některé sekvence DNA před jinými, jsou schopny se vázat prakticky na jakoukoli sekvenci, což je považováno za důsledek flexibility při tvorbě těchto interakcí zprostředkovaných vodou. Kromě toho dochází k nepolárním interakcím mezi postranními řetězci proteinů a deoxyribózovými skupinami a argininový postranní řetězec se vloží do malé drážky DNA na všech 14 místech, kde je obrácen k povrchu oktameru. Distribuce a síla míst vázajících DNA na povrchu oktameru narušuje DNA v jádru nukleosomu. DNA je nerovnoměrně ohnutá a také obsahuje defekty zkroucení. Twist volné B-formy DNA v roztoku je 10,5 bp za otáčku. Celkové zkroucení nukleosomální DNA je však pouze 10,2 bp na otáčku, přičemž se liší od hodnoty 9,4 až 10,9 bp na otáčku.
Domény histonového ocasu
Prodloužení histonového ocasu tvoří až 30% hmotnosti histonů, ale nejsou v krystalových strukturách nukleosomů viditelná kvůli jejich vysoké vnitřní flexibilitě a bylo považováno za do značné míry nestrukturované. N-koncové konce histonů H3 a H2B procházejí kanálem tvořeným menšími rýhami dvou řetězců DNA, vyčnívajících z DNA každých 20 bp. N-terminální ocas histonu H4, na druhé straně, má oblast vysoce bazických aminokyselin (16-25), která, v krystalové struktuře, tvoří jeho interakci s vysoce kyselé povrchové oblasti a H2A, H2B dimeru jiného nukleozomu, což je potenciálně relevantní pro strukturu nukleosomů vyššího řádu. Předpokládá se, že k této interakci dochází i za fyziologických podmínek a naznačuje, že acetylace ocasu H4 narušuje strukturu chromatinu vyššího řádu.
Struktura vyššího řádu
Organizace DNA, kterou dosahuje nukleozom, nemůže zcela vysvětlit balení DNA pozorované v buněčném jádru. Další zhutnění chromatinu do buněčného jádra je nezbytné, ale zatím není dobře pochopeno. Současné chápání je takové, že opakující se nukleozomy s intervenující „linkerovou“ DNA tvoří 10 nm vlákno , popsané jako „perličky na provázku“, a mají poměr balení přibližně pět ku deseti. Řetězec nukleosomů může být uspořádán do 30 nm vlákna , zhutněné struktury s poměrem balení ~ 50 a jehož tvorba je závislá na přítomnosti histonu H1 .
Byla představena krystalová struktura tetranukleosomu, která byla použita k vybudování navrhované struktury 30 nm vlákna jako spouštěče se dvěma starty. O tomto modelu stále existuje určité množství sporů, protože je nekompatibilní s nedávnými daty elektronové mikroskopie . Kromě toho je struktura chromatinu špatně pochopena, ale klasicky se navrhuje, aby 30 nm vlákno bylo uspořádáno do smyček podél centrálního proteinového lešení za vzniku transkripčně aktivního euchromatinu . Další zhutnění vede k transkripčně neaktivnímu heterochromatinu .
Dynamika
Přestože je nukleosom velmi stabilním komplexem protein-DNA, není statický a bylo prokázáno, že prochází řadou různých strukturálních reorganizací, včetně klouzání nukleosomů a expozice místa DNA. V závislosti na kontextu mohou nukleosomy inhibovat nebo usnadňovat vazbu transkripčního faktoru. Pozice nukleosomů jsou řízeny třemi hlavními příspěvky: Za prvé, vnitřní vazebná afinita histonového oktameru závisí na sekvenci DNA. Za druhé, nukleosom může být vytlačen nebo rekrutován kompetitivní nebo kooperativní vazbou jiných proteinových faktorů. Za třetí, nukleozom může být aktivně translokován pomocí ATP-dependentních remodelačních komplexů.
Nucleosome posuvné
Práce prováděné v Bradburyho laboratoři ukázaly, že nukleosomy rekonstituované na sekvenci polohování 5S DNA byly schopné transpozovat se translačně na sousední sekvence, když byly inkubovány tepelně. Pozdější práce ukázaly, že toto přemístění nevyžadovalo narušení histonového oktameru, ale bylo v souladu s tím, že nukleosomy byly schopné „klouzat“ podél DNA v cis . V roce 2008 bylo dále odhaleno, že vazebná místa CTCF fungují jako kotvy pro polohování nukleozomů, takže při použití k zarovnání různých genomových signálů lze snadno identifikovat více lemujících nukleozomů. Ačkoli jsou nukleosomy skutečně mobilní, vyvinuly eukaryoty velkou rodinu enzymů remodelace chromatinu závislých na ATP za účelem změny struktury chromatinu, z nichž mnohé tak činí prostřednictvím klouzání nukleosomů. V roce 2012 laboratoř Beena Pillai prokázala, že klouzání nukleosomů je jedním z možných mechanismů exprese genů specifických pro tkáň. Práce ukazuje, že místo startu transkripce pro geny exprimované v konkrétní tkáni jsou zbaveny nukleosomů, zatímco stejný soubor genů v jiné tkáni, kde nejsou exprimovány, je vázán na nukleozomy.
Expozice v místě DNA
Práce z laboratoře Widom ukázala, že nukleosomální DNA je v rovnováze mezi zabaleným a nebaleným stavem. Měření těchto rychlostí pomocí časově rozlišeného FRET odhalilo, že DNA v nukleosomu zůstává plně zabalena pouze 250 ms, než je rozbalena na 10-50 ms a poté rychle znovu zabalena. To znamená, že DNA nemusí být aktivně disociována z nukleozomu, ale že existuje značný zlomek času, během kterého je plně přístupná. Ve skutečnosti to může být rozšířeno o pozorování, že zavedení sekvence vázající DNA do nukleosomu zvyšuje přístupnost sousedních oblastí DNA, když jsou navázány. Tato náchylnost DNA „dýchat“ v nukleosomu má důležité funkční důsledky pro všechny proteiny vázající DNA, které působí v chromatinovém prostředí. Zejména dynamické dýchání nukleosomů hraje důležitou roli při omezování postupu RNA polymerázy II během prodloužení transkripce.
Oblast bez nukleosomů
Promotory aktivních genů mají oblasti bez nukleosomů (NFR). To umožňuje přístup DNA promotoru k různým proteinům, jako jsou transkripční faktory. Oblast bez nukleosomů obvykle zahrnuje 200 nukleotidů v S. cerevisae Dobře umístěné nukleozomy tvoří hranice NFR. Tyto nukleozomy se nazývají +1-nukleozom a -1 nukleosom a nacházejí se v kanonických vzdálenostech po proudu, respektive proti proudu od startovacího místa transkripce. +1-nukleozom a několik downstream nukleozomů také mají tendenci začlenit variantu histonu H2A.Z.
Modulační struktura nukleosomů
Eukaryotické genomy jsou všudypřítomně spojeny do chromatinu; buňky však musí prostorově a časově regulovat specifické lokusy nezávisle na hromadném chromatinu. Aby se dosáhlo vysoké úrovně kontroly potřebné ke koordinaci jaderných procesů, jako je replikace DNA, oprava a transkripce, buňky vyvinuly řadu prostředků k místní a specifické modulaci struktury a funkce chromatinu. To může zahrnovat kovalentní modifikaci histonů, začlenění histonových variant a nekovalentní remodelaci pomocí ATP-dependentních remodelačních enzymů.
Histonové posttranslační modifikace
Vzhledem k tomu, že byly objeveny v polovině 60. let minulého století, bylo předpovězeno, že modifikace histonů ovlivní transkripci. Skutečnost, že většina nalezených časných posttranslačních modifikací byla soustředěna v prodloužení ocasu, které vyčnívají z jádra nukleosomu, vedla ke dvěma hlavním teoriím ohledně mechanismu modifikace histonu. První z teorií naznačovala, že mohou ovlivnit elektrostatické interakce mezi histonovými ocasy a DNA, aby „uvolnily“ strukturu chromatinu. Později bylo navrženo, že kombinace těchto modifikací mohou vytvořit vazebné epitopy, pomocí kterých lze získávat další proteiny. Nedávno, vzhledem k tomu, že ve strukturovaných oblastech histonů bylo nalezeno více modifikací, bylo uvedeno, že tyto modifikace mohou ovlivnit interakce histon-DNA a histon-histon v jádru nukleosomu. U modifikací (jako je acetylace nebo fosforylace), které snižují náboj globulárního histonového jádra, se předpovídá „uvolnění“ asociace jádro-DNA; síla účinku závisí na umístění modifikace uvnitř jádra. Ukázalo se, že některé modifikace korelovaly s umlčováním genů; jiné se zdají být v korelaci s genovou aktivací. Společné modifikace zahrnují acetylaci , methylaci , nebo ubikvitinaci a lysinu ; methylace z argininu ; a fosforylace na serinu . Informace uložené tímto způsobem jsou považovány za epigenetické , protože nejsou kódovány v DNA, ale jsou stále zděděny do dceřiných buněk. Udržování potlačeného nebo aktivovaného stavu genu je často nutné pro buněčnou diferenciaci .
Varianty histonu
Ačkoli jsou histony během evoluce pozoruhodně konzervovány, bylo identifikováno několik variantních forem. Tato diverzifikace funkce histonu je omezena na H2A a H3, přičemž H2B a H4 jsou většinou invariantní. H2A může být nahrazen H2AZ (což vede ke snížení stability nukleosomů) nebo H2AX (což je spojeno s opravou DNA a diferenciací T buněk ), zatímco neaktivní chromozomy X u savců jsou obohaceny o macroH2A. H3 může být nahrazen H3.3 (což koreluje s aktivačními geny a regulačními prvky) a v centromerách je H3 nahrazen CENPA .
Přestavba nukleosomu závislá na ATP
S pojmem remodelace chromatinu závislého na ATP je spojena řada odlišných reakcí . Ukázalo se, že remodelační enzymy kloužou nukleozomy podél DNA, narušují kontakty histon-DNA do rozsahu destabilizace dimeru H2A/H2B a vytvářejí negativní superhelikální torzi v DNA a chromatinu. V poslední době bylo ukázáno, že remodelační enzym Swr1 zavádí variantní histon H2A.Z do nukleosomů. V současné době není jasné, zda všechny tyto skutečnosti představují odlišné reakce nebo pouze alternativní výsledky společného mechanismu. To, co je sdíleno mezi všemi, a skutečně charakteristickým znakem remodelace chromatinu závislé na ATP, je, že všechny vedou ke změně přístupnosti DNA.
Studie zkoumající aktivaci genů in vivo a ještě překvapivěji remodelace in vitro odhalily, že události remodelace chromatinu a vazba transkripčního faktoru jsou cyklické a periodické povahy. Zatímco důsledky tohoto pro reakční mechanismus remodelace chromatinu nejsou známy, dynamická povaha systému mu může umožnit reagovat rychleji na vnější podněty. Nedávná studie naznačuje, že pozice nukleosomů se během vývoje myších embryonálních kmenových buněk výrazně mění a tyto změny souvisejí s vazbou vývojových transkripčních faktorů.
Dynamická remodelace nukleosomu v genomu kvasinek
Studie v roce 2007 katalogizovaly pozice nukleosomů v kvasinkách a ukázaly, že nukleosomy jsou vyčerpány v promotorových oblastech a počátcích replikace . Zdá se, že přibližně 80% kvasinkového genomu je pokryto nukleozomy a struktura polohování nukleosomů se jasně týká oblastí DNA, které regulují transkripci , oblastí, které jsou transkribovány, a oblastí, které zahajují replikaci DNA. Nejnověji nová studie zkoumala dynamické změny v repozici nukleosomů během události globálního transkripčního přeprogramování, aby se objasnily účinky na posun nukleosomů během transkripčních změn v kvasinkách v celém genomu ( Saccharomyces cerevisiae ). Výsledky naznačují, že nukleosomy, které byly lokalizovány do oblastí promotoru, jsou přemístěny v reakci na stres (jako tepelný šok ). Kromě toho odstranění nukleosomů obvykle odpovídalo transkripční aktivaci a nahrazení nukleosomů obvykle odpovídalo transkripční represi, pravděpodobně proto, že vazebná místa transkripčního faktoru se stala více či méně přístupná. Obecně byly na promotor přemístěny pouze jeden nebo dva nukleozomy, aby se dosáhlo těchto transkripčních změn. Avšak i v chromozomálních oblastech, které nebyly spojeny s transkripčními změnami, bylo pozorováno přemístění nukleozomů, což naznačuje, že pokrytí a odkrytí transkripční DNA nemusí nutně způsobit transkripční událost. Po transkripci musí být oblast rDNA chráněna před jakýmkoli poškozením, což naznačuje, že proteiny HMGB hrají hlavní roli při ochraně oblasti bez nukleosomů.
Sestavení nukleosomů in vitro
Nukleosomy mohou být sestaveny in vitro buď použitím purifikovaných nativních nebo rekombinantních histonů. Jedna standardní technika načítání DNA kolem histonů zahrnuje použití dialýzy solí . Reakci sestávající z histonových oktamerů a templátu nahé DNA lze inkubovat společně při koncentraci soli 2 M. Postupným snižováním koncentrace soli se DNA vyrovná do polohy, kde je obalena kolem histonových oktamerů, čímž se vytvoří nukleosomy. Za vhodných podmínek umožňuje tento rekonstituční proces experimentálně mapovat afinitu polohování nukleosomů dané sekvence.
Disulfidově zesítěné částice jádra nukleosomu
Nedávný pokrok ve výrobě částic jádra nukleosomů se zvýšenou stabilitou zahrnuje místně specifické disulfidové příčné vazby. Do jádrové částice nukleosomu lze zavést dva různé příčné vazby. První zesiluje dvě kopie H2A prostřednictvím zavedeného cysteinu (N38C), což vede k histonovému oktameru, který je stabilní proti ztrátě dimeru H2A/H2B během rekonstituce nukleosomu. Druhé zesíťování může být zavedeno mezi H3 N-koncový histonový konec a konce nukleosomové DNA prostřednictvím začleněného konvertibilního nukleotidu. Zesíťování oktameru DNA-histon stabilizuje částici jádra nukleosomu proti disociaci DNA při velmi nízkých koncentracích částic a při zvýšených koncentracích solí.
Sestavení nukleosomu in vivo
Nukleosomy jsou základní obalovou jednotkou DNA postavené z histonových proteinů, kolem kterých je navinuta DNA. Slouží jako lešení pro tvorbu chromatinové struktury vyššího řádu a také pro vrstvu regulační kontroly genové exprese. Nukleosomy jsou rychle sestaveny na nově syntetizovanou DNA za replikační vidličkou.
H3 a H4
Histony H3 a H4 z rozebraných starých nukleozomů jsou drženy v blízkosti a náhodně distribuovány na nově syntetizované DNA. Jsou sestaveny komplexem chromatin assembly factor-1 (CAF-1), který se skládá ze tří podjednotek (p150, p60 a p48). Nově syntetizované H3 a H4 jsou sestaveny pomocí replikačního spojovacího faktoru (RCAF). RCAF obsahuje podjednotku Asf1, která se váže na nově syntetizované proteiny H3 a H4. Staré proteiny H3 a H4 si zachovávají své chemické modifikace, což přispívá k předávání epigenetického podpisu. Nově syntetizované proteiny H3 a H4 jsou postupně acetylovány na různých lysinových zbytcích jako součást procesu zrání chromatinu. Předpokládá se také, že staré proteiny H3 a H4 v nových nukleosomech získávají enzymy modifikující histon, které označují nové histony, což přispívá k epigenetické paměti.
H2A a H2B
Na rozdíl od starých H3 a H4 se staré histonové proteiny H2A a H2B uvolňují a degradují; proto jsou nově sestavené proteiny H2A a H2B začleněny do nových nukleosomů. H2A a H2B jsou sestaveny do dimerů, které jsou poté naneseny na nukleosomy proteinem 1 pro sestavování nukleosomů (NAP-1), který také napomáhá klouzání nukleosomů. Nukleozomy jsou také rozmístěny pomocí ATP-závislých komplexů remodelace nukleosomů obsahujících enzymy, jako jsou Isw1 Ino80 a Chd1, a následně sestaveny do struktury vyššího řádu.
Galerie
Krystalová struktura částice jádra nukleosomu ( PDB : 1EQZ ) - různé pohledy ukazující detaily skládání a organizace histonu. Histony H2A , H2B , H3 , H4 a DNA jsou barevné.
Viz také
Reference
externí odkazy
- MBInfo - Co jsou nukleosomy
- Nukleosomy na webu Richmond Lab
- Nukleosomy proteopedie
- Nukleosom v PDB
- Dynamická remodelace jednotlivých nukleosomů v eukaryotickém genomu v reakci na transkripční poruchu
- Data a nástroje pro určování polohy nukleosomů online (anotovaný seznam, neustále aktualizován)
- Struktura histonového proteinu
- HistoneDB 2.0 - databáze histonů a variant v NCBI