Genetická obrazovka - Genetic screen
Genetické obrazovka nebo obrazovka mutageneze je experimentální technika používaná k identifikaci a volbu pro jednotlivce, kteří jsou držiteli dokladu o fenotyp zájmu v mutovaného populaci. Genetický screening je tedy typem fenotypového screeningu . Genetické testy mohou poskytnout důležité informace o genové funkci i o molekulárních událostech, které jsou základem biologického procesu nebo dráhy. Zatímco genomové projekty identifikovaly rozsáhlý soupis genů v mnoha různých organismech, genetická vyšetření mohou poskytnout cenný pohled na to, jak tyto geny fungují.
Základní screening
Forwardová genetika (nebo dopředný genetický screening) je přístup používaný k identifikaci genů (nebo sady genů) odpovědných za určitý fenotyp organismu. Reverzní genetika (nebo reverzní genetický screening) na druhé straně analyzuje fenotyp organismu po narušení známého genu. Stručně řečeno, dopředná genetika začíná fenotypem a směřuje k identifikaci odpovědného genu (genů), zatímco reverzní genetika začíná u známého genu a analyzuje účinek jeho narušení analýzou výsledných fenotypů. Přední i reverzní genetická vyšetření mají za cíl určit funkci genů.
Úspěšné dopředné genetické testy mají často dvě klíčové složky. Prvním je definované genetické pozadí používaného organismu a druhým je jednoduchý, ale stálý experimentální postup k identifikaci sledovaných mutantů. Definovaná genetická pozadí umožňují vědcům identifikovat a lokalizovat postižené geny u mutantních jedinců s vyšší účinností. Zjednodušená metoda screeningu je prospěšná, protože umožňuje screening většího počtu jedinců, čímž se zvyšuje pravděpodobnost generování a identifikace sledovaných mutantů.
Vzhledem k tomu, že přirozené alelické mutace jsou vzácné, před screeningem genetici často mutují populaci jedinců tím, že je vystaví známému mutagenu , jako je chemická látka nebo záření, čímž generují mnohem vyšší frekvenci chromozomálních mutací . V některých organismech mohou být mutageny užitečné pro provádění saturačních obrazovek . Saturační obrazovky se používají k odhalení všech genů podílejících se na konkrétním fenotypu organismu nebo druhu. Screening se provádí mapováním mutantů biologického procesu, dokud nebudou nalezeny žádné nové geny / genové mutace. Christiane Nüsslein-Volhard a Eric Wieschaus byli prvními jedinci, kteří provedli tento typ screeningového postupu.
Varianty promítání
Pro objasnění genu, který vede ke sledovanému mutantnímu fenotypu, bylo navrženo mnoho variant screeningu.
Vylepšovač
Screening zesilovače začíná u mutantního jedince, který má ovlivněný sledovaný proces známou genovou mutací. Screen lze poté použít k identifikaci dalších genů nebo genových mutací, které hrají roli v tomto biologickém nebo fyziologickém procesu. Screening genetického zesilovače identifikuje mutace, které zesilují požadovaný fenotyp u již mutovaného jedince. Fenotyp dvojitého mutanta (jedinec s enhancerem i původní mutací pozadí) je výraznější než jeden z fenotypů s jediným mutantem. Zvýšení musí samo o sobě překonat očekávané fenotypy těchto dvou mutací, a proto lze každou mutaci považovat za zesilovač druhé. Izolace mutant zesilovačů může vést k identifikaci interagujících genů nebo genů, které vůči sobě působí redundantně.
Potlačující
Obrazovka supresor se používá k identifikaci mutací supresorové , které zmírňují nebo se vrátit fenotyp původní mutace, v procesu definován jako syntetický životaschopnosti . Supresorové mutace lze popsat jako druhé mutace v místě na chromozomu odlišné od studované mutace, které potlačují fenotyp původní mutace. Pokud je mutace ve stejném genu jako původní mutace, je známá jako intragenní suprese , zatímco mutace lokalizovaná v jiném genu je známá jako extragenní suprese nebo intergenní suprese . Supresorové mutace jsou nesmírně užitečné pro definování funkcí biochemických drah v buňce a vztahů mezi různými biochemickými cestami.
Citlivé na teplotu
Citlivý displej teploty zahrnuje provedení teplotní posun ke zvýšení mutantní fenotyp. Populace pěstovaná při nízké teplotě by měla normální fenotyp; mutace v konkrétním genu by však při vyšší teplotě způsobila jeho nestabilitu. Například obrazovka pro citlivost na teplotu u ovocných mušek může zahrnovat zvýšení teploty v kleci, dokud některé mouchy nevyblednou, a poté otevřít portál, aby ostatní unikly. Jedinci vybraní na obrazovce mohou nést neobvyklou verzi genu zapojeného do sledovaného fenotypu. Výhodou alel nalezených v tomto typu screeningu je, že mutantní fenotyp je podmíněný a lze jej aktivovat jednoduchým zvýšením teploty. Null mutace v tomto genu, může být letální pro embryo a tyto mutanty nebude ani v základním zobrazení. Lee Hartwell a Paul Nurse nezávisle provedli slavnou obrazovku citlivou na teplotu, aby identifikovali mutanty defektní v buněčném cyklu u S. cerevisiae a S. pombe .
Mapování mutantů
Tím, že klasické genetiky přiblížit, výzkumník by pak lokalizovat (mapa) gen na svém chromozomu od křížení s osobami, které nesou jiné neobvyklé vlastnosti a shromažďovat statistické údaje o tom, jak často se tyto dvě vlastnosti zdědil společně. Klasičtí genetici by použili fenotypové vlastnosti k mapování nových mutovaných alel . S příchodem genomových sekvencí pro modelové systémy, jako je Drosophila melanogaster , Arabidopsis thaliana a C. elegans, bylo nyní identifikováno mnoho jednonukleotidových polymorfismů (SNP), které lze použít jako znaky pro mapování. Ve skutečnosti obrazovka Heidelberg , která byla vyvinuta v roce 1980 Nüsslein-Volhardem a Wieschausem, uvolnila cestu budoucím vědcům v této oblasti. SNP jsou preferovanými vlastnostmi pro mapování, protože jsou velmi časté, v řádu jednoho rozdílu na 1000 párů bází, mezi různými odrůdami organismu. Mutageny, jako jsou náhodné inzerce DNA transformací nebo aktivní transpozony, lze také použít ke generování nových mutantů. Výhodou těchto technik je značení nových alel známým molekulárním (DNA) markerem, který může usnadnit rychlou identifikaci genu.
Poziční klonování
Poziční klonování je metoda identifikace genu, při které je gen pro specifický fenotyp identifikován pouze přibližnou chromozomální polohou (nikoli však funkcí); toto je známé jako kandidátská oblast . Zpočátku může být kandidátská oblast definována pomocí technik, jako je vazebná analýza , a poziční klonování je poté použito k zúžení kandidátské oblasti, dokud není nalezen gen a jeho mutace. Poziční klonování typicky zahrnuje izolaci částečně překrývajících se segmentů DNA z genomových knihoven k postupu podél chromozomu směrem ke specifickému genu. V průběhu pozičního klonování je třeba určit, zda je aktuálně uvažovaný segment DNA součástí genu.
Testy použité pro tento účel zahrnují mezidruhovou hybridizaci, identifikaci nemetylovaných ostrovů CpG , zachycování exonu, přímou selekci cDNA , počítačovou analýzu sekvence DNA, screening mutací u postižených jedinců a testy genové exprese. U genomů, ve kterých jsou známy oblasti genetických polymorfismů , zahrnuje poziční klonování identifikaci polymorfismů, které lemují mutaci. Tento proces vyžaduje, aby fragmenty DNA z nejbližšího známého genetického markeru byly postupně klonovány a sekvenovány, aby se každým novým klonem přiblížily mutantní alele. Tento proces produkuje contig mapy z místa a je znám jako chromozomů chůzi . Po dokončení projektů sekvenování genomu, jako je Projekt lidského genomu , může moderní poziční klonování přímo využívat připravené kontigy z databází sekvencí genomu.
Pro každý nový klon DNA je identifikován polymorfismus a testován v populaci mapování na jeho frekvenci rekombinace ve srovnání s mutantním fenotypem. Když je klon DNA na mutantní alele nebo v její blízkosti, měla by být frekvence rekombinace blízká nule. Pokud procházení chromozomů pokračuje mutantní alelou, nové polymorfismy začnou vykazovat zvýšení frekvence rekombinace ve srovnání s mutantním fenotypem. V závislosti na velikosti mapovací populace lze mutovanou alelu zúžit na malou oblast (<30 kB). Porovnání sekvencí mezi divokým typem a mutantní DNA v této oblasti je poté nutné k vyhledání mutace DNA, která způsobuje fenotypový rozdíl.
Moderní poziční klonování může přímo extrahovat informace z projektů genomového sekvenování a stávajících dat analýzou genů v kandidátské oblasti. Potom lze upřednostnit potenciální geny onemocnění z kandidátské oblasti, což potenciálně snižuje množství práce. Geny s expresními vzory v souladu s fenotypem nemoci, vykazující (domnělou) funkci související s fenotypem nebo homologní s jiným genem spojeným s fenotypem, jsou prioritními kandidáty. Zobecnění technik pozičního klonování tímto způsobem je také známé jako poziční objev genů.
Poziční klonování je účinná metoda k nezaujatému izolování genů chorob a používá se k identifikaci genů chorob pro DMD , Huntingtonovu chorobu a cystickou fibrózu . Komplikace v analýze však vznikají, pokud onemocnění vykazuje lokusovou heterogenitu.