Kalení (fluorescence) - Quenching (fluorescence)
Kalení se týká jakéhokoli procesu, který snižuje intenzitu fluorescence dané látky. K ochlazení může dojít řadou procesů, jako jsou reakce v excitovaném stavu , přenos energie, tvorba komplexu a kolizní kalení. V důsledku toho je kalení často silně závislé na tlaku a teplotě . Molekulární kyslík , jodidové ionty a akrylamid jsou běžnými chemickými hasiči. Chloridový ion je dobře známým tlumičem chininové fluorescence. Kalení představuje problém pro okamžité spektroskopické metody, jako je laserem indukovaná fluorescence .
Kalení se používá v optodických čidlech; například kalící účinek kyslíku na určité rutheniové komplexy umožňuje měření nasycení kyslíkem v roztoku. Kalení je základem pro testy přenosu energie z rezonance FORster (FRET). Kalení a ochlazování po interakci se specifickým molekulárně biologickým cílem je základem pro aktivovatelná optická kontrastní činidla pro molekulární zobrazování . Mnoho barviv podléhá samozhášení, které může snížit jas konjugátů protein-barvivo pro fluorescenční mikroskopii , nebo je lze využít v senzorech proteolýzy .
Mechanismy
Přenos rezonanční energie Förster
Existuje několik odlišných mechanismů, kterými lze energii přenášet neradiačně (bez absorpce nebo emise fotonů) mezi dvěma barvivy, dárcem a akceptorem. Försterův rezonanční přenos energie (FRET nebo FET) je dynamický kalící mechanismus, protože k přenosu energie dochází, když je dárce ve vzrušeném stavu. FRET je založena na klasických dipól-dipól interakce mezi přechodových dipóly dárce a akceptoru a je extrémně závislá na donor-akceptorového vzdálenosti, R , pádu rychlostí 1 / R 6 . FRET také závisí na spektrálním překrytí dárce a akceptoru (viz obrázek) a relativní orientaci dipólových momentů přechodu dárce a akceptoru. FRET se obvykle může vyskytovat na vzdálenost až 100 Å.
Přenos elektronů Dexter
Dexter (také známý jako výměna Dexter nebo kolizní přenos energie, hovorově známý jako D externetové E NERGY T ředávání) je další dynamické zhášení mechanismu. Přenos elektronu Dexter je fenomén krátkého dosahu, který exponenciálně klesá se vzdáleností (úměrně e - kR, kde k je konstanta, která závisí na inverzi van der Waalsova poloměru atomu) a závisí na prostorovém překrytí donoru a zhášedla molekulární orbitaly. Ve většině situací dárce-fluorofor-zhášeč-akceptor je Försterův mechanismus důležitější než mechanismus Dexter. Při přenosu energie Förster i Dexter se tvary absorpčních a fluorescenčních spekter barviv nemění.
Přenos elektronů Dexter může být významný mezi barvivem a rozpouštědlem, zvláště když se mezi nimi vytvoří vodíkové vazby.
Exciplex
Tvorba Exciplex (komplex excitovaného stavu) je třetím dynamickým kalícím mechanismem.
Statické kalení
Mechanismus přenosu zbývající energie je statické kalení (také označované jako kalení kontaktů). Statické zhášení může být dominantním mechanismem pro některé sondy reportér-zhášeč. Na rozdíl od dynamického zhášení dochází ke zhášení statickému, když molekuly tvoří komplex v základním stavu, tj. Než dojde k excitaci. Komplex má své vlastní jedinečné vlastnosti, jako je nefluorescenční a jedinečné absorpční spektrum . Agregace barviva je často způsobena hydrofobními efekty - molekuly barviva se skládají dohromady, aby se minimalizoval kontakt s vodou. Rovinná aromatická barviva, která jsou spojena pro asociaci prostřednictvím hydrofobních sil, mohou zlepšit statické kalení. Vysoké teploty a přidávání povrchově aktivních látek mají tendenci narušovat tvorbu komplexu základního stavu.
Srážkové kalení
Ke koliznímu kalení dochází, když excitovaný fluorofor zažije kontakt s atomem nebo molekulou, což může usnadnit neradiační přechody do základního stavu. ... Molekula excitovaného stavu koliduje s molekulou zhášeče a vrací se neradiačně do základního stavu.
Viz také
- Temný zhášeč , pro použití v molekulární biologii.
- Försterův rezonanční přenos energie , fenomén, na který se spoléhají některé techniky kalení