Fluorescenční zobrazovací mikroskopie - Fluorescence-lifetime imaging microscopy

Fluorescenční zobrazovací mikroskopie nebo FLIM je zobrazovací technika založená na rozdílech v exponenciální rychlosti rozpadu fluoroforu ze vzorku. Může být použit jako zobrazovací technika v konfokální mikroskopii , dvoufotonové excitační mikroskopii a multipotonové tomografii.

K vytvoření obrazu ve FLIM se používá spíše životnost (FLT) fluoroforu než jeho intenzita. Životnost fluorescence závisí na místním mikroprostředí fluoroforu, což vylučuje jakákoli chybná měření intenzity fluorescence v důsledku změny jasu světelného zdroje, intenzity osvětlení pozadí nebo omezeného bělení fotografií. Tato technika má také tu výhodu, že minimalizuje účinek rozptylu fotonů v silných vrstvách vzorku. V závislosti na mikroprostředí byla celoživotní měření používána jako indikátor pH , viskozity a koncentrace chemických látek .

Životnost fluorescence

Fluorofor , který je buzen prostřednictvím fotonu klesne do základního stavu s určitou pravděpodobností na základě měr útlumu prostřednictvím řady různých (zářivé a / nebo nonradiative) rozpadu drah. Pro pozorování fluorescence musí být jedna z těchto cest spontánní emisí fotonu. V popisu souboru se emitovaná fluorescence časem rozpadne podle

${\ Displaystyle I (t) = I_ {0} e^{-t/\ tau}}$

kde

${\ displaystyle {\ frac {1} {\ tau}} = \ sum k_ {i}}$.

Ve výše uvedeném čase je čas, je životnost fluorescence, je počáteční fluorescencí v a jsou rychlosti pro každou cestu rozpadu, z nichž alespoň jedna musí být rychlostí rozpadu fluorescence . Ještě důležitější je, že životnost je nezávislá na počáteční intenzitě a vyzařovaném světle. Toho lze využít k provádění neintenzivních měření při chemickém snímání. ${\ displaystyle t}$${\ displaystyle \ tau}$${\ displaystyle I_ {0}}$${\ displaystyle t = 0}$${\ displaystyle k_ {i}}$${\ displaystyle k_ {f}}$${\ displaystyle \ tau}$

Měření

Fluorescenční zobrazování po dobu životnosti poskytuje obrazy s intenzitou každého pixelu určenou , což umožňuje prohlížet kontrast mezi materiály s různou rychlostí rozpadu fluorescence (i když tyto materiály fluoreskují přesně na stejné vlnové délce), a také vytváří obrazy, které ukazují změny v jiných dráhy rozpadu, jako například při zobrazování FRET . ${\ displaystyle \ tau}$

Pulzní osvětlení

Životnost fluorescence lze určit v časové oblasti pomocí pulzního zdroje. Když je populace fluoroforů excitována ultrakrátkým nebo delta pulsem světla, časově rozlišená fluorescence se rozpadne exponenciálně, jak je popsáno výše. Pokud je však excitační impuls nebo detekční odezva široká, naměřená fluorescence d (t) nebude čistě exponenciální. Funkce instrumentální odezvy, IRF (t) bude spojena nebo smíchána s funkcí rozpadu, F (t).

${\ displaystyle {d} (t) = {IRF} (t) \ otimes {F} (t)}$

Instrumentální odezvu zdroje, detektoru a elektroniky lze měřit, obvykle z rozptýleného excitačního světla. Obnovení funkce rozpadu (a odpovídajících životů) představuje další výzvy, protože rozdělení ve frekvenční oblasti má tendenci produkovat vysoký šum, když je jmenovatel blízko nule.

TCSPC

Časově korelované počítání jednoho fotonu ( TCSPC ) se obvykle používá, protože kompenzuje změny intenzity zdroje a amplitudy pulzů jednoho fotonu. Pomocí komerčního zařízení TCSPC lze zaznamenat křivku rozpadu fluorescence s časovým rozlišením až 405 fs. Zaznamenaný histogram rozpadu fluorescence se řídí Poissonovou statistikou, která je brána v úvahu při určování správnosti shody během montáže. TCSPC konkrétněji zaznamenává časy, ve kterých jsou jednotlivé fotony detekovány rychlým jednofotonovým detektorem (typicky fotonásobičem ( PMT ) nebo fotonovou lavinovou fotodiodou (SPAD)) s ohledem na excitační laserový puls. Záznamy se opakují pro více laserových pulzů a po dostatečném počtu zaznamenaných událostí je možné sestavit histogram počtu událostí ve všech těchto zaznamenaných časových bodech. Tento histogram pak lze přizpůsobit exponenciální funkci, která obsahuje požadovanou exponenciální funkci rozpadu životnosti, a podle toho lze extrahovat parametr životnosti. Vícekanálové systémy PMT se 16 až 64 prvky jsou komerčně dostupné, zatímco nedávno představené systémy CMOS s jednou fotonovou lavinovou diodou (SPAD) -TCSPC FLIM mohou nabídnout ještě vyšší počet detekčních kanálů a další levné možnosti.

Metoda hradlování

V této metodě se stále používá pulzní buzení. Než puls dosáhne vzorku, část světla se odráží dichroickým zrcadlem a je detekována fotodiodou, která aktivuje generátor zpoždění ovládající hradlový optický zesilovač (GOI), který sedí před detektorem CCD. GOI umožňuje detekci pouze na zlomek času, když je otevřená po zpoždění. S generátorem nastavitelného zpoždění je tedy člověk schopen sbírat fluorescenční emise po více dobách zpoždění zahrnujících časový rozsah rozpadu fluorescence vzorku. V posledních letech vstoupily na trh integrované zesílené CCD kamery. Tyto kamery se skládají z zesilovače obrazu, CCD snímače a integrovaného generátoru zpoždění. Kamery ICCD s nejkratšími časy hradlování až 200 s a zpožděním po 10 s umožňují rozlišení FLIM v sub nanosekundách. V kombinaci s endoskopem se tato technika používá k intraoperační diagnostice mozkových nádorů.

Fázová modulace

Životnost fluorescence lze určit ve frekvenční doméně metodou fázové modulace. Metoda využívá světelný zdroj, který je pulsovaný nebo modulovaný na vysoké frekvenci (až 500 MHz), jako je LED, diodový laser nebo zdroj spojitých vln kombinovaný s elektrooptickým modulátorem nebo akusticko-optickým modulátorem . Fluorescence je (a.) Demodulována a (b.) Fázově posunuta; obě veličiny se vztahují k charakteristickým dobám rozpadu fluoroforu. Budou také modulovány y-komponenty k excitačním a fluorescenčním sinusovým vlnám a životnost může být určena z modulačního poměru těchto y-komponent. Z metody fázové modulace lze tedy určit 2 hodnoty životnosti. Životnost se stanoví pomocí vhodných postupů pro tyto experimentální parametry. Výhodou frekvenční domény FLIM na bázi PMT nebo kamery je rychlá celoživotní akvizice obrazu, díky čemuž je vhodná pro aplikace, jako je výzkum živých buněk.

Analýza

Cílem analytického algoritmu je extrahovat křivku čistého rozpadu z měřeného rozpadu a odhadnout životnost (y). Toho je obvykle dosaženo přizpůsobením jedné nebo více exponenciálních funkcí. K vyřešení tohoto problému byla vyvinuta řada metod. Nejpoužívanější technikou je iterativní opakovaná konvoluce s nejmenším čtvercem, která je založena na minimalizaci váženého součtu zbytků. V této technice jsou teoretické exponenciální křivky spletené s funkcí odezvy přístroje, která se měří samostatně, a nejvhodnější je najít iterativní výpočet zbytků pro různé vstupy, dokud není nalezeno minimum. Pro sadu pozorování fluorescenčního signálu v časovém bin i se odhad životnosti provádí minimalizací: ${\ displaystyle d ({{t} _ {i}})}$

${\ displaystyle {{\ chi}^{2}} = \ sum \ limits _ {i} {{\ left [{{d} _ {i}} ({{t} _ {i}})-{{ d} _ {0i}} ({{t} _ {i}}, a, \ tau) \ right]}^{2}}}$

Kromě experimentálních obtíží, včetně funkce odezvy nástroje závislé na vlnové délce, není matematické zpracování problému iterativní dekonvoluce přímočaré a jde o pomalý proces, který v počátcích FLIM znemožňoval analýzu pixel po pixelu. Nehodící se metody jsou atraktivní, protože nabízejí velmi rychlé řešení odhadů životnosti. Jednou z hlavních a přímých technik v této kategorii je metoda rychlého určování životnosti (RLD). RLD vypočítává životnost a jejich amplitudy přímo rozdělením křivky rozpadu na dvě části stejné šířky t. Analýza se provádí integrací křivky rozpadu ve stejných časových intervalech t: ${\ Displaystyle \ delta}$${\ Displaystyle \ delta}$

${\ displaystyle {\ begin {matrix} {{D} _ {0}} = \ sum \ limits _ {i = 1}^{K/2} {{{I} _ {i}} \ delta t} & {{D} _ {1}} = \ sum \ limits _ {i = K/2}^{K} {{{I} _ {i}} \ delta t} \\\ end {matrix}}}$

II je zaznamenaný signál v i-tém kanálu a K je počet kanálů. Životnost lze odhadnout pomocí:

${\ displaystyle \ tau = \ delta t/\ ln ({{D} _ {0}}/{{D} _ {1}})}$

Pro více exponenciální rozpady poskytuje tato rovnice průměrnou životnost. Tuto metodu lze rozšířit o analýzu bi-exponenciálních rozpadů. Jednou z hlavních nevýhod této metody je, že nemůže zohlednit účinek odezvy přístroje, a proto by měla být raná část měřených křivek rozpadu v analýzách ignorována. To znamená, že část signálu je zahozena a přesnost pro odhad krátkých životů klesá.

Jednou ze zajímavých vlastností konvoluční věty je, že integrál konvoluce je součinem faktorů tvořících integrál. V transformovaném prostoru pracuje několik technik, které tuto vlastnost využívají k získání čisté křivky rozpadu z měřené křivky. Laplaceova a Fourierova transformace spolu s Laguerrovou Gaussovou expanzí byly použity k odhadu životnosti v transformovaném prostoru. Tyto přístupy jsou rychlejší než metody založené na dekonvoluci, ale trpí problémy se zkrácením a vzorkováním. Navíc aplikace metod, jako je Laguerre Gaussova expanze, je matematicky komplikovaná. U Fourierových metod je životnost jedné exponenciální křivky rozpadu dána vztahem:

${\ displaystyle \ tau = {\ frac {1} {n \ omega}} {\ frac {{A} _ {n}} {{B} _ {n}}}}$

Kde:

${\ displaystyle {\ begin {matrix} {{A} _ {n}} = {\ frac {\ sum \ limits _ {t} {d (t) \ sin (n \ omega t)}} {\ sum \ limity _ {t} {IRF (t) \ sin (n \ omega t)}}}} = {\ frac {\ omega \ tau} {1+{{\ omega}^{2}} {{\ tau}^ {2}}}}, & {{B} _ {n}} = {\ frac {\ sum \ limits _ {t} {d (t) \ cos (n \ omega t)}} {\ sum \ limits _ {t} {IRF \ cos (n \ omega t)}}}} = {\ frac {1} {1+n {{\ omega}^{2}} {{\ tau}^{2}}}} , & \ omega = {\ frac {2 \ pi} {T}} \\\ end {matrix}}}$

an je harmonické číslo a T je celkový časový rozsah detekce.

Aplikace

FLIM byl primárně použit v biologii jako metoda k detekci fotosenzibilizátorů v buňkách a nádorech, stejně jako FRET v případech, kdy je obtížné poměrové zobrazení . Tato technika byla vyvinuta na konci 80. a počátku 90. let minulého století (Gatingova metoda: Bugiel a kol. 1989. König 1989, Fázová modulace: Lakowicz at al. 1992,), než byla koncem 90. let rozšířenější. V buněčné kultuře byl použit ke studiu signalizace receptoru EGF a obchodování s ním. Časová doména FLIM (tdFLIM) byla také použita k ukázání interakce obou typů vrstev proteinů jaderných meziproduktových vláken A a B1 v odlišných homopolymerech v jaderném obalu, které dále vzájemně interagují ve strukturách vyššího řádu. Zobrazování FLIM je zvláště užitečné v neuronech, kde je pro poměrové zobrazení problematické rozptyl světla mozkovou tkání. V neuronech bylo ke studiu proteinů rodiny Ras , CaMKII , Rac a Ran použito zobrazování FLIM pomocí pulzního osvětlení . FLIM byl použit v klinické multiphotonové tomografii k detekci intradermálních rakovinotvorných buněk a také farmaceutických a kosmetických sloučenin.

Nověji se FLIM používá také k detekci flavanolů v rostlinných buňkách

Autofluorescenční koenzymy NAD (P) H a FAD

Vícefotonový FLIM se stále častěji používá k detekci auto-fluorescence z koenzymů jako markerů změn v metabolismu savců.

FRET zobrazování

Protože životnost fluorescence fluoroforu závisí na radiačních (tj. Fluorescenčních) i neradiačních (tj. Zhášejících, FRET) procesech, přenos energie z donorové molekuly do akceptorové molekuly zkrátí životnost dárce. Měření FRET pomocí FLIM tedy může poskytnout metodu pro rozlišení mezi stavy/prostředím fluoroforu. Na rozdíl od měření FRET na základě intenzity jsou měření FRET na základě FLIM také necitlivá na koncentraci fluoroforů a mohou tak odfiltrovat artefakty zavedené změnami koncentrace a intenzity emisí napříč vzorkem.

Viz také

• Fázorový přístup k životnosti fluorescence a spektrálnímu zobrazování

Reference

externí odkazy

• Celoživotní zobrazování v fluorescenčním stavu
• Celoživotní a spektrální analytické nástroje v ImageJ: http://spechron.com
• Fluorescenční celoživotní zobrazovací mikroskopie
• Princip TCSPC FLIM (Becker & Hickl GmbH)