Nukleární magnetická rezonanční spektroskopie proteinů - Nuclear magnetic resonance spectroscopy of proteins

Nukleární magnetická rezonanční spektroskopie proteinů (obvykle zkráceně proteinová NMR ) je obor strukturní biologie, ve kterém se NMR spektroskopie používá k získání informací o struktuře a dynamice proteinů , a také nukleových kyselin a jejich komplexů. Průkopníkem oboru byli mimo jiné Richard R. Ernst a Kurt Wüthrich na ETH a Ad Bax , Marius Clore , Angela Gronenborn na NIH a Gerhard Wagner na Harvardské univerzitě . Stanovení struktury pomocí NMR spektroskopie se obvykle skládá z několika fází, z nichž každá používá samostatný soubor vysoce specializovaných technik. Připraví se vzorek, provedou se měření, uplatní se interpretační přístupy a vypočítá se a ověří struktura.

NMR zahrnuje kvantově mechanické vlastnosti centrálního jádra („ jádra “) atomu. Tyto vlastnosti závisí na místním molekulárním prostředí a jejich měření poskytuje mapu toho, jak jsou atomy chemicky propojeny, jak blízko jsou ve vesmíru a jak rychle se vůči sobě navzájem pohybují. Tyto vlastnosti jsou v zásadě stejné jako vlastnosti používané ve známějším zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) , ale molekulární aplikace používají poněkud odlišný přístup, vhodný pro změnu měřítka z milimetrů (zajímavé pro radiology) na nanometry (vázané atomy jsou obvykle zlomek nanometrů od sebe), faktor milion. Tato změna měřítka vyžaduje pro dlouhodobé měření mnohem vyšší citlivost detekce a stabilitu. Na rozdíl od MRI strukturální biologické studie negenerují přímo obraz, ale spoléhají na složité počítačové výpočty pro generování trojrozměrných molekulárních modelů.

V současné době je většina vzorků zkoumána v roztoku ve vodě, ale vyvíjejí se metody, které budou pracovat také s pevnými vzorky . Sběr dat závisí na umístění vzorku do silného magnetu, odesílání vysokofrekvenčních signálů skrz vzorek a měření absorpce těchto signálů. V závislosti na prostředí atomů v proteinu budou jádra jednotlivých atomů absorbovat různé frekvence rádiových signálů. Kromě toho mohou být absorpční signály různých jader narušeny sousedními jádry. Tyto informace lze použít k určení vzdálenosti mezi jádry. Tyto vzdálenosti mohou být použity k určení celkové struktury proteinu.

Typická studie může zahrnovat to, jak dva proteiny vzájemně interagují, případně s cílem vyvinout malé molekuly, které lze použít ke zkoumání normální biologie interakce („ chemická biologie “) nebo k poskytnutí možných vedení pro farmaceutické použití ( vývoj léčiv) ). Interagující pár proteinů může být často identifikován studiemi lidské genetiky, což naznačuje, že interakce může být narušena nepříznivými mutacemi, nebo mohou hrát klíčovou roli v normální biologii „modelového“ organismu, jako je ovocná muška, kvasnice červ C. elegans nebo myši. K přípravě vzorku se obvykle používají metody molekulární biologie k výrobě množství bakteriální fermentací . To také umožňuje změnu izotopického složení molekuly, což je žádoucí, protože izotopy se chovají odlišně a poskytují způsoby identifikace překrývajících se signálů NMR.

příprava vzorků

Vzorek NMR se připraví v tenkostěnné skleněné trubici .

Proteinová nukleární magnetická rezonance se provádí na vodných vzorcích vysoce purifikovaných proteinů. Obvykle se vzorek skládá z 300 až 600 mikrolitrů s koncentrací bílkovin v rozmezí 0,1 - 3 milimolární . Zdroj proteinu může být buď přirozený, nebo produkovaný v produkčním systému pomocí technik rekombinantní DNA prostřednictvím genetického inženýrství . Rekombinantně exprimované proteiny je obvykle snazší vyrobit v dostatečném množství a tato metoda umožňuje izotopové značení .

Purifikovaný protein se obvykle rozpustí v pufrovacím roztoku a upraví se na požadované podmínky rozpouštědla. Vzorek NMR se připraví v tenkostěnné skleněné trubici .

Sběr dat

Proteinová NMR využívá k získání informací o proteinu vícerozměrné experimenty s nukleární magnetickou rezonancí. V ideálním případě každé odlišné jádro v molekule zažívá odlišné elektronické prostředí, a proto má zřetelný chemický posun, díky kterému je možné jej rozpoznat. Avšak u velkých molekul, jako jsou proteiny, může být počet rezonancí typicky několik tisíc a jednorozměrné spektrum se nevyhnutelně náhodně překrývá. Proto se provádějí vícerozměrné experimenty, které korelují frekvence odlišných jader. Dodatečné rozměry snižují možnost překrývání a mají větší informační obsah, protože korelují signály z jader v určité části molekuly. Magnetizace je do vzorku přenesena pomocí pulzů elektromagnetické ( radiofrekvenční ) energie a mezi jádry pomocí zpoždění; proces je popsán takzvanými pulzními sekvencemi . Pulzní sekvence umožňují experimentátorovi prozkoumat a vybrat konkrétní typy spojení mezi jádry. Řada experimentů s nukleární magnetickou rezonancí použitých na proteinech spadá do dvou hlavních kategorií - jedna, kde je magnetizace přenášena chemickými vazbami, a druhá, kde je přenos prováděn prostorem, bez ohledu na strukturu vazeb. První kategorie se používá k přiřazení různých chemických posunů ke konkrétnímu jádru a druhá se používá především ke generování omezení vzdálenosti použitých při výpočtu struktury a při přiřazení neznačeným proteinem.

V závislosti na koncentraci vzorku, magnetickém poli spektrometru a typu experimentu může jeden multidimenzionální experiment nukleární magnetické rezonance na vzorku proteinu trvat hodiny nebo dokonce několik dní, než se získá vhodný poměr signálu k šumu průměrováním signálu a umožněním dostatečného vývoje přenosu magnetizace prostřednictvím různých dimenzí experimentu. Pokud jsou věci stejné, experimenty s vyšší dimenzí budou trvat déle než experimenty s nižší dimenzí.

Typicky je prvním experimentem měřeným s izotopem značeným proteinem 2D heteronukleární spektrum s jednoduchou kvantovou korelací (HSQC), kde „heteronukleární“ označuje jádra jiná než 1H. Teoreticky má heteronukleární jednoduchá kvantová korelace jeden pík pro každý H vázaný na heteronukleus. Tak, v 15N-HSQC, s 15 N značeného proteinu, jeden signál se očekává, že se na každý atom dusíku v zadní kosti, s výjimkou prolinu , který nemá amidovou vodíku v důsledku cyklické povahy svého řetězce. Ke každému zbytku přispívá dalších 15N-HSQC signálů vazbou dusík-vodík v jeho postranním řetězci (W, N, Q, R, H, K). 15N-HSQC je často označován jako otisk prstu proteinu, protože každý protein má jedinečný vzorec pozic signálu. Analýza 15N-HSQC umožňuje výzkumným pracovníkům vyhodnotit, zda je přítomen očekávaný počet píků, a identifikovat tak možné problémy způsobené více konformacemi nebo heterogenitou vzorku. Relativně rychlý heteronukleární experiment s jednoduchou kvantovou korelací pomáhá určit proveditelnost následných delších, nákladnějších a propracovanějších experimentů. Pouze z heteronukleární jediné kvantové korelace není možné přiřadit píky konkrétním atomům.

Přiřazení rezonance

Aby bylo možné analyzovat data nukleární magnetické rezonance, je důležité získat pro protein rezonanční přiřazení, tj. Zjistit, který chemický posun odpovídá kterému atomu. Toho je obvykle dosaženo sekvenční chůzí pomocí informací odvozených z několika různých typů NMR experimentu. Přesný postup závisí na tom, zda je protein izotopicky značen, nebo ne, protože řada přiřazovacích experimentů závisí na uhlíku-13 a dusíku-15.

Porovnání COZY a TOCSY 2D spektra pro aminokyselinu, jako je glutamát nebo methionin . TOCSY předvádí diagonální crosspeaky mezi všemi protony ve spektru, ale COZY má pouze crosspeaky mezi sousedy.

Homonukleární nukleární magnetická rezonance

U neznačeného proteinu je obvyklým postupem zaznamenat soubor dvojrozměrných experimentů homonukleární nukleární magnetické rezonance pomocí korelační spektroskopie (COZY), z nichž několik typů zahrnuje konvenční korelační spektroskopii, celkovou korelační spektroskopii (TOCSY) a nukleární Overhauserovu efektovou spektroskopii (NOESY) . Dvourozměrný experiment nukleární magnetické rezonance vytváří dvojrozměrné spektrum. Jednotky obou os jsou chemické posuny. COZY a TOCSY přenášejí magnetizaci prostřednictvím chemických vazeb mezi sousedními protony. Konvenční experiment s korelační spektroskopií je schopen přenášet magnetizaci mezi protony na sousedních atomech, zatímco v experimentu s celkovou korelační spektroskopií jsou protony schopné přenášet magnetizaci, takže se přenáší mezi všechny protony, které jsou spojeny sousedními atomy. V konvenční korelační spektroskopii tedy alfa proton přenáší magnetizaci na beta protony, beta protony se přenášejí na alfa a gama protony, pokud jsou přítomny, pak se gama proton přenáší na beta a delta protony a proces pokračuje . V celkové korelační spektroskopii jsou alfa a všechny ostatní protony schopné přenášet magnetizaci na beta, gama, delta, epsilon, pokud jsou spojeny souvislým řetězcem protonů. Kontinuální řetězec protonů je postranním řetězcem jednotlivých aminokyselin . Tyto dva experimenty se tedy používají k vybudování takzvaných spinových systémů, tj. Sestavení seznamu rezonancí chemického posunu peptidového protonu, alfa protonů a všech protonů z postranního řetězce každého zbytku . Které chemické posuny odpovídají tomu, která jádra v spinovém systému jsou určena konvenčními konektivitami korelační spektroskopie a skutečností, že různé typy protonů mají charakteristické chemické posuny. K propojení různých spinových systémů v sekvenčním pořadí je třeba použít experiment spektroskopie s jaderným Overhauserovým efektem. Protože tento experiment přenáší magnetizaci prostorem, ukáže příčné řeči pro všechny protony, které jsou v prostoru blízko, bez ohledu na to, zda jsou ve stejném spinovém systému nebo ne. Sousední zbytky jsou ze své podstaty blízko v prostoru, takže přiřazení mohou provádět vrcholy v NOESY s jinými spinovými systémy.

Jedním z důležitých problémů využívajících homonukleární nukleární magnetickou rezonanci je překrývání mezi píky. K tomu dochází, když různé protony mají stejné nebo velmi podobné chemické posuny. Tento problém se zvyšuje s tím, jak se protein zvětšuje, takže homonukleární nukleární magnetická rezonance je obvykle omezena na malé proteiny nebo peptidy.

Jaderná magnetická rezonance dusíku-15

Hlavní článek: Heteronukleární jednoduchá kvantová koherentní spektroskopie

Nejčastěji se provádí 15N experiment je 1 H- 15 N HSQC. Experiment je vysoce citlivý, a proto jej lze provést poměrně rychle. Často se používá ke kontrole vhodnosti proteinu pro stanovení struktury pomocí NMR, jakož i pro optimalizaci podmínek vzorku. Je to jeden ze standardních souborů experimentů používaných ke stanovení struktury roztoku proteinu. HSQC lze dále rozšířit na trojrozměrné a NMR experimenty, jako je 15 N-TOCSY-HSQC a 15 N-NOESY-HSQC.

Schéma HNCA a HNCOCA pro čtyři sekvenční zbytky. Dimenze dusíku-15 je kolmá na obrazovku. Každé okno je zaměřeno na chemický posun dusíku této aminokyseliny. Sekvenční přiřazení se provádí porovnáním chemických posunů alfa uhlíku. V HNCA každý zbytek vidí alfa uhlík sebe a předchozího zbytku. HNCOCA vidí pouze alfa uhlík předchozího zbytku.

Magnetická rezonance uhlíku-13 a dusíku-15

Hlavní článek: Triple-resonance nukleární magnetická rezonanční spektroskopie

Když je protein označen uhlíkem-13 a dusíkem-15, je možné zaznamenat experimenty s trojitou rezonancí, které přenášejí magnetizaci přes peptidovou vazbu, a tak spojují různé spinové systémy prostřednictvím vazeb. To se obvykle provádí pomocí některých z následujících experimentů, HNCO , HN (CA) CO }, HNCA , HN (CO) CA , HNCACB a CBCA (CO) NH . Všech šest experimentů se skládá z roviny 1 H- 15 N (podobné spektru HSQC) rozšířené o uhlíkový rozměr. V HN (CA) CO , každý H N rovina obsahuje vrcholy z karbonylového uhlíku od jejího zbytku, jakož předcházejícímu v pořadí. HNCO obsahuje chemický posun karbonyl uhlíku pouze z předchozího zbytku, ale je mnohem citlivější než HN (CA) CO . Tyto experimenty umožňují každý 1 H 15 N vrcholem, který byl spojen s předchozím karbonylový uhlík, a sekvenční přiřazení pak může být provedeno tím, že odpovídá posuny každého spinový systém vlastních a předchozí uhlíky. HNCA a HN (CO) CA pracuje podobně, jen s alfa uhlíky (C α ) spíše než karbonylů a HNCACB a CBCA (CO) NH obsahuje jak uhlík alfa a beta uhlík (C β ). K vyřešení překrytí v uhlíkové dimenzi je obvykle zapotřebí několik z těchto experimentů. Tento postup je obvykle méně nejednoznačný než metoda založená na NOESY, protože je založena na přenosu dluhopisů. V metodách založených na NOESY se objeví další píky odpovídající atomům, které jsou blízko v prostoru, ale které nepatří k sekvenčním zbytkům, což matou proces přiřazování. Po počátečním přiřazení sekvenční rezonance, je obvykle možné rozšířit úkol od C alfa a C P na zbytku postranního řetězce za použití experimentů, jako je HCCH-TOCSY, který je v podstatě TOCSY experiment vyřešen v další dimenzi uhlíku.

Generace omezení

Aby bylo možné provádět strukturální výpočty, je třeba vygenerovat řadu experimentálně určených omezení. Ty spadají do různých kategorií; nejpoužívanější jsou omezovače vzdálenosti a úhlové zábrany.

Omezovače vzdálenosti

Crosspeak v experimentu NOESY znamená prostorovou blízkost mezi dvěma dotyčnými jádry. Každý pík lze tedy převést na maximální vzdálenost mezi jádry, obvykle mezi 1,8 a 6 angstromů . Intenzita vrcholu NOESY je úměrná vzdálenosti mínus 6. výkonu, takže vzdálenost je určena podle intenzity píku. Vztah intenzity a vzdálenosti není přesný, proto se obvykle používá rozsah vzdálenosti.

Je velmi důležité přiřadit NOESY píky správným jádrům na základě chemických posunů. Pokud je tento úkol prováděn ručně, je to obvykle velmi pracné, protože proteiny mají obvykle tisíce NOESY vrcholů. Některé počítačové programy, jako jsou PASD/ XPLOR-NIH , UNIO , CYANA , ARIA / CNS a AUDANA/ PONDEROSA-C/ S na integrační platformě NMR, provádějí tento úkol automaticky na ručně předem zpracovaných seznamech pozic píků a objemů píků, spojených na výpočet struktury. Přímý přístup k nezpracovaným datům NOESY bez těžkopádné potřeby iterativně vylepšených seznamů špiček zatím poskytuje pouze algoritmus PASD implementovaný v XPLOR-NIH , přístup ATNOS/CANDID implementovaný v softwarovém balíčku UNIO a PONDEROSA-C/S a tím skutečně zaručuje objektivní a efektivní spektrální analýzu NOESY.

Abychom získali co nejpřesnější přiřazení, je velkou výhodou mít přístup k experimentům NOESY s uhlíkem-13 a dusíkem-15, protože pomáhají vyřešit překrývání v protonové dimenzi. To vede k rychlejším a spolehlivějším přiřazením a následně k lepším strukturám.

Úhlové zábrany

Kromě distančních omezovačů lze generovat také omezení torzních úhlů chemických vazeb, typicky úhly psi a phi . Jedním z přístupů je použít Karplusovu rovnici ke generování úhlových omezení ze spojovacích konstant . Jiný přístup využívá chemické posuny ke generování úhlových omezení. Obě metody využívají skutečnosti, že geometrie kolem alfa uhlíku ovlivňuje vazebné konstanty a chemické posuny, takže vzhledem ke spojovacím konstantám nebo chemickým posunům lze kvalifikovaně odhadnout torzní úhly.

Orientační omezení

Hlavní článek: Zbytková dipolární spojka
Modré šipky představují orientaci vazby N -H vybraných peptidových vazeb. Stanovením orientace dostatečného množství vazeb vzhledem k vnějšímu magnetickému poli lze určit strukturu proteinu. Ze záznamu PDB 1KBH

Molekuly analytu ve vzorku lze částečně uspořádat s ohledem na vnější magnetické pole spektrometru manipulací s podmínkami vzorku. Mezi běžné techniky patří přidání bakteriofágů nebo bicel do vzorku nebo příprava vzorku v nataženém polyakrylamidovém gelu . To vytváří místní prostředí, které upřednostňuje určité orientace nesférických molekul. Normálně jsou v roztoku NMR průměrné dipolární vazby mezi jádry kvůli rychlému převrhování molekuly. Mírné přelidnění jedné orientace znamená, že zbývá pozorovat zbytkovou dipolární spojku . Dipolární vazba se běžně používá v pevné fázi NMR a poskytuje informace o relativní orientaci vazebných vektorů vzhledem k jedinému globálnímu referenčnímu rámci. Orientace NH vektoru je typicky sondována v experimentu podobném HSQC. Zpočátku byly zbytkové dipolární spojky použity pro upřesnění dříve určených struktur, ale byly také provedeny pokusy o určení struktury de novo.

Výměna vodík – deuterium

Hlavní článek: Výměna vodík – deuterium

NMR spektroskopie je specifická pro jádro. Může tedy rozlišovat mezi vodíkem a deuteriem. Amidové protony v proteinové výměně snadno s rozpouštědlem, a pokud rozpouštědlo obsahuje jiný izotop, typicky deuterium , reakce může být monitorována NMR spektroskopií. Jak rychle se daný amid vyměňuje, odráží jeho dostupnost rozpouštědla. Směnné kurzy amidů mohou tedy poskytovat informace o tom, které části proteinu jsou pohřbeny, vodíkově vázány atd. Běžnou aplikací je srovnání výměny volné formy a komplexu. Amidy, které se stanou chráněnými v komplexu, jsou považovány za v interakčním rozhraní.

Výpočet struktury

Určení struktury nukleární magnetické rezonance generuje soubor struktur. Struktury se budou sbíhat, pouze pokud jsou data dostatečná k tomu, aby diktovala konkrétní záhyb. V těchto strukturách to platí pouze pro část struktury. Z položky PDB 1SSU .

Experimentálně stanovená omezení mohou být použita jako vstup pro proces výpočtu struktury. Výzkumníci využívající počítačové programy jako XPLOR-NIH , CYANA nebo GeNMR se pokoušejí uspokojit co nejvíce omezení, kromě obecných vlastností proteinů, jako jsou délky a úhly vazeb. Algoritmy převádějí omezení a obecné vlastnosti bílkovin na energetické termíny a poté se snaží tuto energii minimalizovat. Výsledkem procesu je soubor struktur, které, pokud by data byla dostatečná k diktování určitého záhybu, budou konvergovat.

Ověření struktury

Je důležité si uvědomit, že získaný soubor struktur je „experimentálním modelem“, tj. Reprezentací určitého druhu experimentálních dat. Uznat tuto skutečnost je opravdu důležité, protože to znamená, že model může být dobrou nebo špatnou reprezentací těchto experimentálních dat. Obecně bude kvalita modelu záviset jak na množství a kvalitě experimentálních dat použitých k jeho generování, tak na správné interpretaci těchto dat.

Je důležité si uvědomit, že každý experiment má přidružené chyby. Náhodné chyby ovlivní reprodukovatelnost a přesnost výsledných struktur. Pokud jsou chyby systematické, bude ovlivněna přesnost modelu. Přesnost udává stupeň reprodukovatelnosti měření a je často vyjádřena jako rozptyl souboru naměřených dat za stejných podmínek. Přesnost však udává, do jaké míry se měření blíží své „skutečné“ hodnotě.

V ideálním případě bude model proteinu přesnější, čím více odpovídá skutečné molekule, která představuje, a bude přesnější, protože existuje menší nejistota ohledně poloh jejich atomů. V praxi neexistuje žádná „standardní molekula“, se kterou by bylo možné porovnávat modely proteinů, takže přesnost modelu je dána mírou shody mezi modelem a souborem experimentálních dat. Historicky měly struktury určené NMR obecně nižší kvalitu než struktury určené rentgenovou difrakcí. To je částečně způsobeno nižším množstvím informací obsažených v datech získaných pomocí NMR. Z tohoto důvodu se stalo běžnou praxí stanovit kvalitu NMR souborů porovnáním s jedinečnou konformací určenou rentgenovou difrakcí pro stejný protein. Struktura rentgenové difrakce však nemusí existovat, a protože proteiny v roztoku jsou flexibilní molekuly, protein reprezentovaný jedinou strukturou může vést k podcenění vnitřní variace atomových poloh proteinu. Soubor konformací, určený NMR nebo rentgenovou krystalografií, může být lepší reprezentací experimentálních dat proteinu než jedinečná konformace.

Užitečnost modelu bude alespoň částečně dána mírou přesnosti a přesnosti modelu. Přesný model s relativně špatnou přesností by mohl být užitečný ke studiu evolučních vztahů mezi strukturami sady proteinů, zatímco racionální návrh léku vyžaduje jak přesné, tak přesné modely. Model, který není přesný, bez ohledu na stupeň přesnosti, se kterým byl získán, nebude příliš užitečný.

Vzhledem k tomu, že proteinové struktury jsou experimentální modely, které mohou obsahovat chyby, je velmi důležité tyto chyby detekovat. Proces zaměřený na detekci chyb se nazývá validace. Existuje několik metod ověřování struktur, některé jsou statistické jako PROCHECK a CO KDYŽ, zatímco jiné jsou založeny na fyzikálních principech jako CheShift nebo směs statistických a fyzikálních principů PSVS .

Dynamika

Viz také: Dynamika bílkovin

Kromě struktur může nukleární magnetická rezonance poskytnout informace o dynamice různých částí proteinu . To obvykle zahrnuje měření relaxačních časů, jako je T 1 a T 2 k určení pořadí parametry, korelační časy a chemické směnných kurzů. Relaxace NMR je důsledkem lokálních fluktuujících magnetických polí v molekule. Místní fluktuující magnetická pole jsou generována molekulárními pohyby. Tímto způsobem mohou měření relaxačních časů poskytnout informace o pohybech v molekule na atomové úrovni. V NMR studiích dynamiky proteinů je preferovaným jádrem ke studiu izotop dusíku-15, protože jeho relaxační časy jsou relativně jednoduché, pokud jde o molekulární pohyby. To však vyžaduje izotopové značení proteinu. K T 1 a T 2 relaxačních časů může být měřena pomocí různých typů HSQC založené experimenty. Typy pohybů, které lze detekovat, jsou pohyby, které se vyskytují v časovém měřítku v rozmezí od přibližně 10 pikosekund do přibližně 10 nanosekund. Kromě toho lze studovat i pomalejší pohyby, které se odehrávají v časovém měřítku v rozmezí od přibližně 10 mikrosekund do 100 milisekund. Jelikož se však atomy dusíku nacházejí hlavně v páteři proteinu, výsledky odrážejí především pohyby páteře, což je nejpevnější část molekuly proteinu. Výsledky získané z relaxačních měření dusíku-15 tedy nemusí být reprezentativní pro celý protein. Proto byly nedávno vyvinuty techniky využívající relaxační měření uhlíku-13 a deuteria , které umožňují systematické studium pohybů postranních řetězců aminokyselin v proteinech. Náročný a speciální případ studie týkající se dynamiky a flexibility peptidů a proteinů plné délky představuje neuspořádané struktury. V dnešní době je uznávaným konceptem, že proteiny mohou vykazovat flexibilnější chování známé jako porucha nebo nedostatek struktury; místo statického obrazu představujícího plně funkční stav proteinu je však možné popsat soubor struktur. V této oblasti je zastoupeno mnoho pokroků, zejména pokud jde o nové pulzní sekvence, technologické zlepšení a přísné školení výzkumných pracovníků v této oblasti.

NMR spektroskopie na velkých proteinech

Spektroskopie nukleární magnetické rezonance byla tradičně omezena na relativně malé proteiny nebo proteinové domény. To je částečně způsobeno problémy s řešením překrývajících se píků u větších proteinů, ale toto bylo zmírněno zavedením značení izotopů a multidimenzionálních experimentů. Dalším vážnějším problémem je skutečnost, že u velkých proteinů se magnetizace uvolňuje rychleji, což znamená, že je méně času na detekci signálu. To zase způsobuje, že se vrcholy stávají širšími a slabšími a nakonec zmizí. Dvě techniky byly zavedeny zeslabit relaxace: příčný relaxace optimalizovaný spektroskopie (Trosy) a deuterace proteinů. Pomocí těchto technik bylo možné studovat proteiny v komplexu s 900 kDa chaperonem GroES - GroEL .

Automatizace procesu

Stanovení struktury pomocí NMR je tradičně časově náročný proces, který vyžaduje interaktivní analýzu dat vysoce kvalifikovaným vědcem. Existuje značný zájem o automatizaci procesu za účelem zvýšení propustnosti stanovení struktury a zpřístupnění proteinové NMR neodborníkům (viz strukturní genomika ). Mezi dva časově nejnáročnější procesy patří přiřazení rezonance specifické pro sekvenci (přiřazení páteře a postranního řetězce) a úkoly přiřazení NOE. Bylo publikováno několik různých počítačových programů, které se automatizovaným způsobem zaměřují na jednotlivé části celkového procesu určování struktury NMR. Nejvíce pokroku bylo dosaženo pro úkol automatizovaného přiřazování NOE. Dosud byl navržen pouze přístup FLYA a UNIO k automatickému provedení celého procesu stanovení struktury proteinové NMR bez jakéhokoli lidského zásahu. Nedávno moduly v NMRFAM-SPARKY, jako jsou APES (dvoupísmenný kód: ae), I-PINE/PINE-SPARKY (dvoupísmenný kód: ep; webový server I-PINE ) a PONDEROSA (dvoupísmenný kód: c3, nahoru; webový server PONDEROSA ) jsou integrovány tak, že nabízí plnou automatizaci s možností vizuálního ověření v každém kroku. Rovněž bylo vyvinuto úsilí o standardizaci protokolu pro výpočet struktury, aby byla rychlejší a přístupnější automatizaci.

Viz také

Reference

Další čtení

externí odkazy

Knihovní zdroje o
nukleární magnetické rezonanční spektroskopii proteinů