Reportérský gen - Reporter gene

Diagram toho, jak je reportérový gen použit ke studiu regulační sekvence.

V molekulární biologii je reportérový gen (často jednoduše reportér ) gen, který vědci připojí k regulační sekvenci jiného požadovaného genu v bakteriích , buněčné kultuře , zvířatech nebo rostlinách. Takové geny se nazývají reportéři, protože charakteristiky, které udělují organizmům, které je exprimují, jsou snadno identifikovatelné a měřitelné, nebo proto, že jsou volitelnými markery . Reportérské geny se často používají jako indikace toho, zda byl určitý gen převzat nebo exprimován v populaci buněk nebo organismů.

Běžné reportérské geny

Aby vědci zavedli reportérový gen do organismu, umístí reportérový gen a požadovaný gen do stejného DNA konstruktu, který má být vložen do buňky nebo organismu. U bakterií nebo prokaryotických buněk v kultuře je to obvykle ve formě kruhové molekuly DNA nazývané plazmid . Je důležité použít reportérový gen, který není nativně exprimován ve studované buňce nebo organismu, protože exprese reportéru je používána jako marker pro úspěšné vychytávání požadovaného genu.

Běžně používané reportérové ​​geny, které indukují vizuálně identifikovatelné charakteristiky, obvykle zahrnují fluorescenční a luminiscenční proteiny. Mezi příklady patří gen, který kóduje zelený fluorescenční protein medúzy (GFP), který způsobuje, že buňky, které jej exprimují, svítí zeleně pod modrým světlem, enzym luciferáza , který katalyzuje reakci s luciferinem za vzniku světla, a červený fluorescenční protein z genu dsRed  [ fr ] . GUS gen byl běžně používají v zařízeních, ale luciferázu a GFP jsou stále častější.

Běžným reportérem v bakteriích je lacZ gen E. coli , který kóduje protein beta-galaktosidázu . Tento enzym způsobuje, že bakterie exprimující gen vypadají modře, když rostou na médiu, které obsahuje analog substrátu X-gal . Příkladem selektovatelného markeru, který je také reportérem v bakteriích, je gen chloramfenikol acetyltransferázy (CAT), který propůjčuje rezistenci vůči antibiotiku chloramfenikol .

Testy transformace a transfekce

Mnoho metod transfekce a transformace - dva způsoby exprese cizího nebo modifikovaného genu v organismu - je účinné pouze u malého procenta populace podrobené těmto technikám. Je tedy nezbytný způsob identifikace těchto několika úspěšných událostí vychytávání genů. Reportérské geny použité tímto způsobem jsou normálně exprimovány pod svým vlastním promotorem (oblasti DNA, které iniciují transkripci genu) nezávisle na tom, který z požadovaných zavedených genů; reportérový gen může být exprimován konstitutivně (to znamená, že je „vždy zapnutý“) nebo indukovatelně externím zásahem, jako je zavedení isopropyl-P-D-1-thiogalaktopyranosidu (IPTG) do systému p-galaktosidázy. Výsledkem je, že exprese reportérového genu je nezávislá na expresi požadovaného genu, což je výhoda, když je požadovaný gen exprimován pouze za určitých specifických podmínek nebo ve tkáních, ke kterým je obtížný přístup.

V případě reportérů s volitelnými markery, jako je CAT, lze transfekovanou populaci bakterií pěstovat na substrátu, který obsahuje chloramfenikol . Pouze ty buňky, které úspěšně přijaly konstrukt obsahující gen CAT, přežijí a množí se za těchto podmínek.

Testy genové exprese

Reportérské geny mohou být použity ke stanovení exprese požadovaného genu, který je normálně obtížné kvantitativně testovat. Reportérské geny mohou produkovat protein, který má jen málo zjevný nebo okamžitý účinek na buněčnou kulturu nebo organismus. V ideálním případě nejsou přítomny v nativním genomu, aby mohly izolovat expresi reportérového genu v důsledku exprese zájmového genu.

K aktivaci reportérových genů mohou být exprimovány konstitutivně , kde jsou přímo připojeny k požadovanému genu za účelem vytvoření genové fúze . Tato metoda je příkladem použití cis -působících prvků, kde jsou dva geny pod stejnými promotorovými prvky a jsou transkribovány do jediné molekuly RNA posla . MRNA je pak přeložen do proteinu. Je důležité, aby se oba proteiny dokázaly správně sklopit do svých aktivních konformací a interagovat se svými substráty navzdory fúzi. Při stavbě DNA konstruktu je obvykle zahrnut segment DNA kódující flexibilní linkerovou linkerovou oblast, takže reportér a genový produkt budou navzájem jen minimálně interferovat. Reportérské geny mohou být také vyjádřeny indukcí během růstu. V těchto případech, trans -acting prvky, jako jsou transkripční faktory se používají k expresi reportérového genu.

Reportovací genový test se stále častěji používá při vysokovýkonném screeningu (HTS) k identifikaci malých molekulárních inhibitorů a aktivátorů proteinových cílů a cest pro objevování léčiv a chemickou biologii . Protože samotné reportérské enzymy (např. Luciferáza světlušek ) mohou být přímými cíli malých molekul a zmást interpretaci dat HTS, byly vyvinuty nové návrhy reportérů koincidence zahrnující potlačení artefaktů.

Promotérské testy

Reportérské geny mohou být použity k testování aktivity konkrétního promotoru v buňce nebo organismu. V tomto případě neexistuje žádný samostatný „gen zájmu“; reportérový gen je jednoduše umístěn pod kontrolu cílového promotoru a aktivita produktu reportérového genu je kvantitativně měřena. Výsledky jsou obvykle hlášeny relativně k aktivitě pod "konsensuálním" promotorem, o kterém je známo, že indukuje silnou genovou expresi.

Další použití

Složitější použití reportérových genů ve velkém měřítku je ve dvouhybridním screeningu , jehož cílem je identifikovat proteiny, které mezi sebou nativně interagují in vivo .

Viz také

• Reportérský systém GUS

Reference

externí odkazy

• Hlavní body výzkumu a aktualizované informace o reportérových genech.
• Barvení embryí celé myši na aktivitu β-galaktosidázy (lacZ)