Termodynamika nukleových kyselin - Nucleic acid thermodynamics

Termodynamika nukleových kyselin je studium toho, jak teplota ovlivňuje strukturu nukleových kyselin dvouvláknové DNA (dsDNA). Teplota tání ( T _m ) je definována jako teplota, při které je polovina řetězců DNA ve stavu náhodných cívek nebo jednovláknových (ssDNA). T _m závisí na délce molekuly DNA a její specifické nukleotidové sekvenci. DNA, když je ve stavu, kdy jsou její dvě vlákna disociována (tj. Molekula dsDNA existuje jako dvě nezávislá vlákna), je označována jako denaturovaná vysokou teplotou.

Pojmy

Hybridizace

Hybridizace je proces navázání nekovalentní interakce specifické pro sekvenci mezi dvěma nebo více komplementárními vlákny nukleových kyselin do jednoho komplexu, který se v případě dvou řetězců označuje jako duplex . Oligonukleotidy , DNA nebo RNA se za normálních podmínek navážou na svůj komplement, takže se dvě dokonale komplementární vlákna na sebe snadno váží. Aby se snížila rozmanitost a získaly energeticky nejvýhodnější komplexy, používá se v laboratorní praxi technika zvaná žíhání . Vzhledem k různé molekulární geometrii nukleotidů však jediná nekonzistence mezi těmito dvěma vlákny způsobí, že vazba mezi nimi bude energeticky méně výhodná. Měření účinků nekompatibility bází kvantifikací teploty, při které mohou žíhání dvou vláken poskytovat informace o podobnosti v sekvenci bází mezi dvěma žíhanými vlákny. Komplexy mohou být disociovány tepelnou denaturací , také označovanou jako tání. Při absenci vnějších negativních faktorů lze procesy hybridizace a tání po sobě opakovat neomezeně dlouho, což vytváří základ pro polymerázovou řetězovou reakci . Nejčastěji se tvoří páry nukleových bází A = T a G≡C, z nichž poslední je stabilnější.

Denaturace

Denaturace DNA, také nazývaná DNA tání, je proces, při kterém se dvouvláknová deoxyribonukleová kyselina odvíjí a rozděluje na jednovláknové řetězce rozbitím hydrofobních stohovacích atrakcí mezi bázemi. Viz Hydrofobní efekt . Oba termíny se používají k popisu procesu, ke kterému dochází při zahřívání směsi, ačkoli „denaturace“ může také znamenat oddělení řetězců DNA indukované chemikáliemi, jako je formamid nebo močovina .

Proces denaturace DNA lze použít k analýze některých aspektů DNA. Protože párování bází cytosin / guanin je obecně silnější než párování bází adenin / thymin, množství cytosinu a guaninu v genomu (nazývané „ obsah GC “) lze odhadnout měřením teploty, při které taje genomová DNA. Vyšší teploty jsou spojeny s vysokým obsahem GC.

Denaturaci DNA lze také použít k detekci sekvenčních rozdílů mezi dvěma různými sekvencemi DNA. DNA se zahřeje a denaturuje do jednovláknového stavu a směs se ochladí, aby se vlákna mohla rehybridizovat. Mezi podobnými sekvencemi se tvoří hybridní molekuly a jakékoli rozdíly mezi těmito sekvencemi povedou k narušení párování bází. V genomickém měřítku vědci tuto metodu použili k odhadu genetické vzdálenosti mezi dvěma druhy, což je proces známý jako hybridizace DNA-DNA . V kontextu jediné izolované oblasti DNA lze použít denaturační gradientové gely a teplotní gradientové gely k detekci přítomnosti malých neshod mezi dvěma sekvencemi, což je proces známý jako gelová elektroforéza s teplotním gradientem .

Metody analýzy DNA založené na teplotě tání mají tu nevýhodu, že jsou zástupci pro studium podkladové sekvence; Sekvenování DNA je obecně považováno za přesnější metodu.

Proces tavení DNA se také používá v technikách molekulární biologie, zejména v polymerázové řetězové reakci . Ačkoliv teplota tání DNA není diagnostický v technice, metody pro odhad T _m jsou důležité pro určení vhodných teplot pro použití v protokolu. Teploty tání DNA mohou být také použity jako proxy pro vyrovnání sil hybridizace sady molekul, např. Oligonukleotidových sond DNA mikročipů .

Žíhání

Žíhání v genetice znamená, že se komplementární sekvence jednovláknové DNA nebo RNA spárují vodíkovými vazbami za vzniku dvouvláknového polynukleotidu . Předtím, než může dojít k žíhání, může být nutné jedno z řetězců fosforylovat enzymem, jako je kináza, aby došlo k řádné vodíkové vazbě. Termín žíhání se často používá k popisu vazby DNA sondy nebo vazby primeru k řetězci DNA během polymerázové řetězové reakce . Termín je také často používán k popisu reformace ( renaturace ) reverzně komplementárních vláken, která byla oddělena teplem (tepelně denaturována). Proteiny, jako je RAD52, mohou pomoci při hybridizaci DNA. Žíhání řetězců DNA je klíčovým krokem na cestách homologní rekombinace . Zejména během meiózy , syntéza závislá na vlákno žíhání je hlavní cestou homologní rekombinace.

Stohování

Stabilita tání stohů párů bází (B DNA)
Krok	Tání ΔG ° ₃₇ (Kcal/mol)
TA	-0,12
TG nebo CA	-0,78
CG	-1,44
AG nebo CT	-1,29
AA nebo TT	-1,04
NA	-1,27
GA nebo TC	-1,66
CC nebo GG	-1,97
AC nebo GT	-2.04
GC	-2,70

Stohování je stabilizační interakce mezi plochými povrchy sousedních základen. Stohování se může stát s jakoukoli stranou základny, tj. 5'-5 ', 3'-3' a naopak.

Stohování „volných“ molekul nukleových kyselin přispívá hlavně mezimolekulární silou , konkrétně elektrostatickou přitažlivostí mezi aromatickými kruhy, což je proces známý také jako stohování pí . U biologických systémů s vodou jako rozpouštědlem přispívá hydrofobní účinek a pomáhá při tvorbě šroubovice. Stohování je hlavním stabilizačním faktorem dvojité šroubovice DNA.

Příspěvek stohování k volné energii molekuly lze experimentálně odhadnout pozorováním ohýbané skládané rovnováhy v proříznuté DNA . Taková stabilizace závisí na sekvenci. Rozsah stabilizace se mění v závislosti na koncentraci soli a teplotě.

Termodynamika dvoustavového modelu

K výpočtu hodnot T _m se používá několik vzorců . Některé vzorce jsou přesnější při předpovídání teplot tání duplexů DNA. U DNA oligonukleotidů, tj. Krátkých sekvencí DNA, lze termodynamiku hybridizace přesně popsat jako dvoustavový proces. V této aproximaci je opomíjena možnost přechodných parciálních vazebných stavů při tvorbě stavu dvou vláken ze dvou jednovláknových oligonukleotidů. Za tohoto předpokladu lze elegantně popsat termodynamické parametry pro tvorbu dvouvláknové nukleové kyseliny AB z jednovláknových nukleových kyselin A a B.

AB ↔ A + B

Rovnovážná konstanta pro tuto reakci je . Podle Van’t Hoffovy rovnice je vztah mezi volnou energií Δ G a K Δ G ° = - RT ln K , kde R je ideální zákonitá konstanta plynu a T je Kelvinova teplota reakce. To pro systém nukleových kyselin dává ${\ displaystyle K = {\ frac {[A] [B]} {[AB]}}}$

${\ Displaystyle \ Delta G^{\ circ} =-RT \ ln {\ frac {[A] [B]} {[AB]}}}$ .

Teplota tání, T _m , nastává, když se polovina dvouvláknové nukleové kyseliny disociovala. Pokud nejsou přítomny žádné další nukleové kyseliny, pak [A], [B] a [AB] budou stejné a rovnají se polovině počáteční koncentrace dvouvláknové nukleové kyseliny, [AB] _{počáteční} . To dává výraz pro teplotu tání duplexu nukleové kyseliny

${\ Displaystyle T_ {m} =-{\ frac {\ Delta G^{\ circle}} {R \ ln {\ frac {[AB] _ {initial}} {2}}}}}$ .

Protože Δ G ° = Δ H ° - T Δ S °, T _m je také dáno vztahem

${\ Displaystyle T_ {m} = {\ frac {\ Delta H^{\ circle}} {\ Delta S^{\ circle} -R \ ln {\ frac {[AB] _ {initial}} {2}} }}}$ .

Termíny Δ H ° a Δ S ° jsou obvykle uvedeny pro asociaci a ne pro disociační reakci (viz například metoda nejbližšího souseda). Tento vzorec se pak změní na:

${\ Displaystyle T_ {m} = {\ frac {\ Delta H^{\ circle}} {\ Delta S^{\ circ}+R \ ln ([A] _ {total}-[B] _ {total} /2)}}}$ , kde [B] _celkem ≤ [A] _celkem .

Jak již bylo zmíněno, tato rovnice je založena na předpokladu, že se na tavení podílejí pouze dva stavy: stav s dvojitým vláknem a stav s náhodnou cívkou. Nukleové kyseliny se však mohou roztavit v několika přechodných stavech. K vysvětlení takového komplikovaného chování je třeba použít metody statistické mechaniky , což je zvláště důležité pro dlouhé sekvence.

Odhad termodynamických vlastností ze sekvence nukleové kyseliny

Předchozí odstavec ukazuje, jak spolu souvisí teplota tání a termodynamické parametry (Δ G ° nebo Δ H ° & Δ S °). Z pozorování teplot tání lze experimentálně určit termodynamické parametry. Naopak, a je to důležité pro aplikace, když jsou známy termodynamické parametry dané sekvence nukleové kyseliny, lze předpovědět teplotu tání. Ukazuje se, že pro oligonukleotidy mohou být tyto parametry dobře aproximovány modelem nejbližšího souseda.

Metoda nejbližšího souseda

Interakce mezi bázemi na různých vláknech závisí do určité míry na sousedních bázích. Místo toho, aby se šroubovice DNA považovala za řetězec interakcí mezi páry bází, model nejbližšího souseda považuje spirálu DNA za řetězec interakcí mezi „sousedními“ páry bází. Například níže uvedená DNA má interakce nejbližších sousedů označené šipkami.

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

5 'CGTTGA 3'

3 'GCAACT 5'

Volná energie tvorby této DNA z jednotlivých vláken, Δ G °, je reprezentována (při 37 ° C) jako

Δ G ° ₃₇ (předpovězeno) = Δ G ° ₃₇ (zahájení C/G) + Δ G ° ₃₇ (CG/GC) + Δ G ° ₃₇ (GT/CA) + Δ G ° ₃₇ (TT/AA) + Δ G ° ₃₇ (TG/AC) + Δ G ° ₃₇ (GA/CT) + Δ G ° ₃₇ (zahájení A/T)

S výjimkou iniciačního členu C/G první termín představuje volnou energii prvního páru bází, CG, v nepřítomnosti nejbližšího souseda. Druhý termín zahrnuje jak volnou energii tvorby druhého páru bází, GC, tak interakci stohování mezi tímto párem bází a předchozím párem bází. Zbývající podmínky jsou definovány podobně. Obecně je volná energie tvorby duplexu nukleové kyseliny

${\ Displaystyle \ Delta G_ {37}^{\ circ} (\ mathrm {total}) = \ Delta G_ {37}^{\ circle} (\ mathrm {zasvěcení})+\ součet _ {i = 1}^ {10} n_ {i} \ Delta G_ {37}^{\ circ} (i)}$ ,

kde představuje volnou energii spojenou s jedním z deseti možných párů nejbližších sousedních nukleotidů a představuje její počet v sekvenci. ${\ Displaystyle \ Delta G_ {37}^{\ circ} (i)}$ ${\ displaystyle n_ {i}}$

Každý termín Δ G ° má entalpické, Δ H ° a entropické, Δ S ° parametry, takže změna volné energie je také dána vztahem

${\ Displaystyle \ Delta G^{\ circ} (\ mathrm {total}) = \ Delta H _ {\ mathrm {total}}^{\ circle} -T \ Delta S _ {\ mathrm {total}}^{\ circle }}$ .

Hodnoty Δ H ° a Δ S ° byly stanoveny pro deset možných párů interakcí. Ty jsou uvedeny v tabulce 1 spolu s hodnotou A G ° vypočítanou při 37 ° C. Pomocí těchto hodnot se vypočítá hodnota Δ G ₃₇ ° pro výše uvedený duplex DNA jako −22,4 kJ/mol. Experimentální hodnota je -21,8 kJ/mol.

Tabulka 1. Parametry nejbližších sousedů pro duplexy DNA/DNA v 1 M NaCl.
Sekvence nejbližších sousedů (5'-3 '/3'-5')	${\ displaystyle \ Delta H}$ ° kJ/mol	${\ displaystyle \ Delta S}$ ° J/(mol · K)	${\ displaystyle \ Delta G}$ ° ₃₇ kJ/mol
AA/TT	-33,1	−92,9	−4,26
AT/TA	−30,1	−85,4	−3,67
TA/AT	−30,1	−89,1	-2,50
CA/GT	−35,6	-95,0	−6.12
GT/CA	−35,1	-93,7	−6,09
CT/GA	−32,6	-87,9	−5,40
GA/CT	-34,3	−92,9	−5,51
CG/GC	-44,4	−113,8	−9,07
GC/CG	-41,0	−102,1	−9,36
GG/CC	-33,5	-83,3	-7,66
Pár základen terminálu A/T	9.6	17.2	4.31
Pár základen terminálu G/C	0,4	−11,7	4,05

Parametry spojené s deseti skupinami sousedů uvedenými v tabulce 1 jsou určeny z bodů tání krátkých oligonukleotidových duplexů. Kupodivu to funguje tak, že pouze osm z deseti skupin je nezávislých.

Model nejbližšího souseda lze rozšířit za páry Watson-Crick, aby zahrnoval parametry pro interakce mezi neshodami a sousedními páry základen. To umožňuje odhad termodynamických parametrů sekvencí obsahujících izolované nesoulady, jako např. (Šipky označující nesoulad)

↓↓↓

5 'GGACTGACG 3'

3 'CCTGGCTGC 5'

Tyto parametry byly získány z experimentů s tavením a v literatuře lze nalézt rozšíření tabulky 1, které obsahuje nesoulad.

Realističtějším způsobem modelování chování nukleových kyselin se zdá být mít parametry, které závisí na sousedních skupinách na obou stranách nukleotidu, což dává tabulku se záznamy jako „TCG/AGC“. To by však zahrnovalo přibližně 32 skupin pro párování Watson-Crick a ještě více pro sekvence obsahující nesoulad; počet experimentů tání DNA potřebných k získání spolehlivých údajů pro tolik skupin by byl nepohodlně vysoký. Existují však i jiné prostředky pro přístup k termodynamickým parametrům nukleových kyselin: technologie microarray umožňuje hybridizační monitorování desítek tisíc sekvencí paralelně. Tato data v kombinaci s teorií molekulární adsorpce umožňují stanovení mnoha termodynamických parametrů v rámci jednoho experimentu a přesahují rámec modelu nejbližšího souseda. Obecně předpovědi z metody nejbližšího souseda celkem dobře souhlasí s experimentálními výsledky, ale existují nějaké neočekávané odlehlé sekvence, které vyžadují další vhledy. Nakonec bychom měli také zmínit zvýšenou přesnost poskytovanou rozbalovacími testy s jednou molekulou, které poskytují množství nových pohledů na termodynamiku hybridizace DNA a platnost modelu nejbližšího souseda.

Viz také

Bod tání
Primer (molekulární biologie) pro výpočty T _m
Základní pár
Komplementární DNA
Western blot

Languages

In other projects