Trávení v gelu - In-gel digestion
Trávení-gelu krok je součástí přípravy vzorků pro hmotnostní spektrometrie identifikaci proteinů v průběhu proteomické analýzy . Metodu představil v roce 1992 Rosenfeld. Zůstávají nesčetné úpravy a vylepšení základních prvků postupu.
Krok trávení v gelu zahrnuje primárně čtyři kroky; odbarvování, redukce a alkylace (R&A) cysteinů v proteinu, proteolytické štěpení proteinu a extrakce generovaných peptidů .
Destaining
Proteiny, které byly odděleny 1D nebo 2D PAGE, jsou obvykle vizualizovány barvením barvivy jako Coomassie Brilliant Blue (CBB) nebo stříbrem . I když je citlivost metody výrazně nižší, je použití Coomassie častější u vzorků určených pro hmotnostní spektrometrii, protože barvení stříbrem zhoršuje analýzu. Po vyříznutí sledovaného proteinového pásu z gelu vyžaduje většina protokolů před pokračováním odbarvení proteinů .
Řešení odbarvení pro CBB obsahuje obvykle na vyrovnávací sůl hydrogenuhličitanu amonného (NH 4 HCO 3 ) a podíl 30% až 50% organického rozpouštědla, (většinou acetonitril ). Hydrofobní interakce mezi proteinem a CBB jsou redukovány organickou frakcí roztoku. Iontová část roztoku současně snižuje elektrostatické vazby mezi barvivem a kladně nabitými aminokyselinami proteinu. Na rozdíl od směsi vody s organickým rozpouštědlem se zvyšuje účinnost odbarvování. Zvýšení teploty podporuje proces odbarvování. Postup odbarvování je do určité míry (<10%) doprovázen ztrátou bílkovin. Kromě toho odstranění CBB nemá vliv na výtěžek peptidů při hmotnostním spektrometrickém měření.
V případě stříbra obarví proteinových pásů se odbarvení dosahuje oxidací na kovové stříbro připojeného k proteinu krevní soli nebo peroxid vodíku (H 2 O 2 ). Uvolněné ionty stříbra jsou následně komplexovány thiosíranem sodným .
Redukce a alkylace (R & A)
Po barvení a odbarvování gelů často následuje redukce a alkylace (r & a) cystinů nebo cysteinů v proteinech. Tím se disulfidové vazby proteinů nevratně rozbijí a získá se optimální vývoj terciární struktury . Redukce na thiol se dosáhne reakcí s chemikáliemi obsahujícími sulfhydrylové nebo fosfinové skupiny, jako je dithiothreitol (DTT) nebo tris-2-karboxyethylfosfin hydrochlorid (TCEP). V průběhu následné nevratné alkylací SH skupin s jodacetamidem jsou cysteiny transformovány do stabilního S-carboxyamidomethylcysteine (CAM addukt: -CH 2 -CONH 2 ). Molekulová hmotnost aminokyselinového zbytku cysteinu se tím zvýší ze 103,01 Da na 160,03 Da.
Redukce a alkylace cysteinových zbytků zlepšuje výtěžek peptidů a pokrytí sekvencí a identifikaci proteinů s vysokým počtem disulfidových vazeb. Kvůli vzácnosti aminokyseliny cysteinu pro většinu proteinů nemá krok výzkumu a zlepšení vliv na hmotnostní spektrometrickou analýzu. Pro kvantitativní a homogenní alkylaci cysteinů je rozhodující poloha kroku modifikace v procesu přípravy vzorku. Při denaturační elektroforéze se důrazně doporučuje provést reakci před provedením elektroforézy, protože v gelu jsou volné akrylamidové monomery schopné nevratně modifikovat cysteinové zbytky. Výsledné akrylamidové adukty mají molekulovou hmotnost 174,05 Da .
Trávení v gelu
Poté se provede stejnojmenný krok metody, trávení proteinů v gelu. Tímto postupem se protein štěpí enzymaticky na omezený počet kratších fragmentů. Tyto fragmenty se nazývají peptidy a umožňují identifikaci proteinu s jejich charakteristickou hmotou a vzorem. Serinové proteázy trypsin je nejběžnější enzym použitý v analytice bílkovin. Trypsin štěpí peptidovou vazbu konkrétně na karboxylovém konci základních aminokyselin argininu a lysinu . Pokud je v přímém sousedství místa řezu kyselá aminokyselina, jako je kyselina asparagová nebo kyselina glutamová , rychlost hydrolýzy je snížena, prolinový C-konec místa řezání hydrolýzu zcela inhibuje .
Nežádoucím vedlejším účinkem použití proteolytických enzymů je vlastní trávení proteázy. Aby se tomu zabránilo, byly v minulosti do trávicího pufru přidány ionty Ca2 + . V dnešní době většina dodavatelů nabízí modifikovaný trypsin, kde selektivní methylace lysinů omezuje autolytickou aktivitu na místa řezání argininu. Nemodifikovaný trypsin má nejvyšší aktivitu mezi 35 ° C a 45 ° C. Po úpravě se optimální teplota změní na rozmezí 50 ° C až 55 ° C. Jiné enzymy používané pro trávení in-gel jsou endo proteázy Lys-C , Glu-C , Asp-N a Lys-N . Tyto proteázy štěpí specificky pouze na jedné aminokyselině, např. Asp-N štěpí na N-konci kyseliny asparagové. Proto se získá nižší počet delších peptidů.
Analýza úplné primární sekvence proteinu s použitím pouze jedné proteázy není obvykle možná. V těchto případech se doporučuje trávení cílového proteinu několika přístupy s různými enzymy. Výsledné překrývající se peptidy umožňují sestavení kompletní sekvence proteinu.
Pro trávení musí být proteiny fixované v matrici gelu zpřístupněny pro proteázu. Předpokládá se, že permeace enzymu do gelu je usnadněna dehydratací kousků gelu zpracováním s acetonitrilem a následným bobtnáním v trávicím pufru obsahujícím proteázu. Tento postup se opírá o předpoklad, že proteáza proniká do gelu procesem bobtnání. Různé studie o penetraci enzymů do gelu ukázaly, že proces je téměř úplně řízen difúzí. Zdá se, že sušení gelu tento proces nepodporuje. Proto musí být zlepšení trávení v gelu dosaženo redukcí způsobu enzymu k jeho substrátu, např. Rozřezáním gelu na co nejmenší kousky.
Obvykle je trávení v gelu prováděno jako přes noc. Pro použití trypsinu jako proteázy a teploty 37 ° C je doba inkubace zjištěná ve většině protokolů 12-15 hodin. Experimenty týkající se trvání procesu digesce však ukázaly, že po 3 hodinách je dostatek materiálu pro úspěšnou hmotnostní spektrometrickou analýzu. Kromě toho optimalizace podmínek pro proteázu při teplotě a pH umožňuje dokončení trávení vzorku za 30 minut.
Povrchově aktivní látka (detergenty) může pomoci při solubilizaci a denaturaci proteinů v gelu, a tím zkrátit dobu trávení a zvýšit štěpení proteinů a počet a množství extrahovaných peptidů, zejména pro lipofilní proteiny, jako jsou membránové proteiny . Štěpitelné detergenty jsou detergenty, které se po trávení štěpí, často za kyselých podmínek. Díky tomu je přidání detergentů kompatibilní s hmotnostní spektrometrií.
Extrakce
Po ukončení trávení musí být peptidy generované v tomto procesu extrahovány z gelové matrice. Toho je dosaženo jedním nebo několika extrakčními kroky. Gelové částice se inkubují s extrakčním roztokem a supernatant se sebere. Při první extrakci se získá téměř veškerý peptid, opakování extrakčního kroku může zvýšit výtěžek celého procesu pouze o 5-10%. Ke splnění požadavků na peptidy s různými fyzikálními a chemickými vlastnostmi se provádí iterativní extrakce bazickými nebo kyselými roztoky. Pro extrakci kyselých peptidů se používá roztok podobný koncentraci a složení trávicího pufru; bazické peptidy se extrahují v závislosti na zamýšlené metodě hmotnostní spektrometrie nízko koncentrovaným kyselým roztokem kyseliny mravenčí pro ESI a kyselinou trifluoroctovou pro MALDI . Studie na modelových proteinech ukázaly izolaci přibližně 70–80% očekávaného výtěžku peptidu extrakcí z gelu. Mnoho protokolů obsahuje další frakci acetonitrilu k extrakčnímu roztoku, který je v koncentracích nad 30% (obj./obj.) Účinný při snižování adsorpce peptidů na povrch reakčních zkumavek a špiček pipet . Kapalina ze spojených extraktů se odpaří v odstředivé odparce . Pokud byla pro základní extrakci použita těkavá sůl hydrogenuhličitanu amonného , je částečně odstraněna v procesu sušení. Vysušené peptidy mohou být skladovány při -20 ° C po dobu nejméně šesti měsíců.
Kritické úvahy a aktuální trendy
Některé hlavní nevýhody běžných protokolů pro digesci v gelu jsou prodloužený čas potřebný a více kroků zpracování, díky čemuž je metoda náchylná k chybám s ohledem na kontaminace (zejména keratin ). Tyto nevýhody byly do značné míry odstraněny vývojem optimalizovaných protokolů a specializovaných reakčních zkumavek.
Závažnější než potíže s manipulací jsou ztráty materiálu při zpracování vzorků. Analýza hmotnostní spektrometrické bílkoviny se často provádí na hranici detekce, takže i malé ztráty mohou diktovat úspěch nebo neúspěch celé analýzy. Tyto ztráty jsou způsobeny vymýváním během různých kroků zpracování, adsorpcí na povrch reakčních zkumavek a špiček pipet , neúplnou extrakcí peptidů z gelu a / nebo špatnou ionizací jednotlivých peptidů v hmotnostním spektrometru . V závislosti na fyzikálně-chemických vlastnostech peptidů se ztráty mohou pohybovat mezi 15 a 50%. Kvůli inherentní heterogenitě peptidů nebylo dosud nalezeno univerzálně platné řešení pro tuto hlavní nevýhodu metody.
Komerční implementace
Komerční implementace trávení v gelu je třeba rozdělit na produkty pro laboratoře s vysokou a nízkou propustností.
Vysoký výkon
Vzhledem k vysoce časově a pracovně náročnému standardnímu postupu byla metoda trávení v gelu omezena na relativně malý počet proteinových skvrn, které se měly zpracovávat najednou. Proto se ukázalo, že je ideálním objektem pro automatizační ambice k překonání těchto omezení pro průmyslové a servisní laboratoře. Dnes je v laboratořích, kde se digesce v gelu provádí ve velkém množství, postup obvykle automatizovaný. Stupeň automatizace se liší od jednoduchých pipetovacích robotů po vysoce sofistikovaná řešení typu „vše v jednom“, která nabízejí automatizovaný pracovní postup od gelové po hmotnostní spektrometrii. Systémy se obvykle skládají ze sběrače skvrn, trávicího robotu a spotteru.
Výhodami jiné automatizace než většího počtu míst, která se mají zpracovávat najednou, je omezená manuální práce a vylepšená standardizace . Vzhledem k mnoha manipulačním krokům metody se výsledky ručního procesu mohou lišit v závislosti na obratnosti uživatele a riziko kontaminace je vysoké. Proto je kvalita výsledků popsána jako jedna z hlavních výhod automatizovaného procesu.
Nevýhodou automatizovaných řešení jsou náklady na roboty, údržbu a spotřební materiál a také složité nastavení procesu. Vzhledem k tomu, že automatický výběr vyžaduje digitalizované informace o umístění skvrn, musí být analýza gelového obrazu pro relevantní skvrny provedena pomocí softwaru vyžadujícího standardizované zobrazovací metody a speciální skenery. Tento zdlouhavý postup zabrání výzkumníkovi ve spontánní identifikaci několika zajímavých míst z jednoho gelu, stejně jako v potřebě provozovat systémy na plnou kapacitu. Výsledné množství dat z následné automatizované analýzy MS je dalším problémem systémů s vysokou propustností, protože jejich kvalita je často sporná a vyhodnocení těchto dat trvá podstatně déle než jejich sběr.
Nízká propustnost
Zmíněné nevýhody omezují rozumné použití automatických systémů trávení v gelu na rutinní laboratoř, zatímco výzkumná laboratoř s požadavkem flexibilního využívání nástrojů identifikace proteinů zůstává častěji u manuálních metod s nízkou propustností pro gelové štěpení a MS analýza. Na tuto skupinu zákazníků se zaměřuje průmysl s několika systémy souprav pro trávení v gelu.
Většina systémů soupravy je pouhým souborem chemikálií a enzymů potřebných pro trávení v gelu, zatímco základní protokol zůstává nezměněn od výše uvedeného manuálního standardního postupu. Výhodou těchto produktů pro nezkušeného zákazníka je zaručené fungování různých řešení v kombinaci s hotovým protokolem pro celý proces.
Několik společností se pokusilo zlepšit proces manipulace s trávením v gelu, aby umožnilo snadnější a standardizovanější pracovní postup i při manuální přípravě vzorků. Montage In-Gel Digest Kit od Millipore je založen na standardním protokolu, ale umožňuje zpracování velkého počtu paralelních vzorků přenesením manipulace s kousky gelu na modifikovanou 96jamkovou mikrodestičku. Roztoky pro různé kroky digesce v gelu se napipetují do jamek této destičky, zatímco odstraňování kapalin se provádí přes dno jamek vakuovou pumpou . Tento systém zjednodušuje manipulaci s více kroky pipetování pomocí vícekanálových pipet a dokonce i pipetovacích robotů. Ve skutečnosti někteří výrobci vysoce výkonných systémů přijali systém pro práci se svými roboty. To ilustruje orientaci tohoto řešení soupravy na laboratoře s větším počtem vzorků.
Reference
externí odkazy
- Flash film ilustrující experimentální postup optimalizovaného trávení v gelu, jak je popsáno v Granvogl et al.
Viz také
- Zymografie , nepříbuzná technika v molekulární biologii, která zahrnuje také trávení proteinů v elektroforetickém gelu