Nemrznoucí protein - Antifreeze protein

Hmyzí nemrznoucí bílkovina, typ Tenebrio
Struktura beta-šroubovicového nemrznoucího proteinu Tenebrio molitor
Identifikátory
Symbol	AFP
Pfam	PF02420
InterPro	IPR003460
SCOP2	1ezg / SCOPe / SUPFAM
Dostupné proteinové struktury: Pfam   struktur / EKOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj Součet PDB shrnutí struktury

Hmyzí nemrznoucí bílkovina (CfAFP)
Struktura beta-šroubovicového nemrznoucího proteinu Choristoneura fumiferana (smrk budworm)
Identifikátory
Symbol	CfAFP
Pfam	PF05264
InterPro	IPR007928
SCOP2	1m8n / SCOPe / SUPFAM
Dostupné proteinové struktury: Pfam   struktur / EKOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj Součet PDB shrnutí struktury

Rybí nemrznoucí protein typu I
Identifikátory
Symbol	?
InterPro	IPR000104
SCOP2	1wfb / SCOPe / SUPFAM

Rybí nemrznoucí protein typu II
Identifikátory
Symbol	?
InterPro	IPR002353
CATH	2py2
SCOP2	2afp / SCOPe / SUPFAM

Rybí nemrznoucí protein typu III
Identifikátory
Symbol	?
InterPro	IPR006013
SCOP2	1hg7 / SCOPe / SUPFAM
Viz také doména SAF ( InterPro :  IPR013974 ).

Proteiny podobné mořskému ledu vázající led
Identifikátory
Symbol	DUF3494
Pfam	PF11999
InterPro	IPR021884
Dostupné proteinové struktury: Pfam   struktur / EKOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj Součet PDB shrnutí struktury

Nemrznoucí proteiny ( AFP ) nebo led strukturující proteiny ( ISP ) označují třídu polypeptidů produkovaných určitými živočichy , rostlinami , houbami a bakteriemi, které umožňují jejich přežití při teplotách pod bodem mrazu vody. AFP se vážou na malé ledové krystaly, aby inhibovaly růst a rekrystalizaci ledu, která by jinak byla smrtelná. Existuje také stále více důkazů, že AFP interagují s membránami savčích buněk, aby je chránily před poškozením chladem. Tato práce navrhuje zapojení AFP do aklimatizace za studena .

Nekoligativní vlastnosti

Na rozdíl od široce používaného automobilového nemrznoucího prostředku, ethylenglykolu , AFP nesnižují bod tuhnutí úměrně koncentraci. Spíše fungují nekoordinačním způsobem. Tento jev jim umožňuje působit jako nemrznoucí směs v koncentracích 1/300 až 1/500 koncentrací jiných rozpuštěných rozpuštěných látek. Jejich nízká koncentrace minimalizuje jejich účinek na osmotický tlak . Neobvyklé vlastnosti AFP jsou přičítány jejich selektivní afinitě pro specifické formy krystalického ledu a výsledné blokádě procesu nukleace ledu.

Tepelná hystereze

AFP vytvářejí rozdíl mezi teplotou tání a bodem mrazu (teplota rozpadu krystalů ledu vázaného na AFP) známou jako tepelná hystereze. Přidání AFP na rozhraní mezi pevným ledem a kapalnou vodou inhibuje termodynamicky zvýhodněný růst ledových krystalů. Růst ledu je kineticky inhibován AFP pokrývajícími vodou přístupné povrchy ledu.

Tepelná hystereze se snadno měří v laboratoři nanolitrovým osmometrem . Organismy se liší svými hodnotami tepelné hystereze. Maximální úroveň tepelné hystereze vykazované rybím AFP je přibližně -3,5 ° C (Sheikh Mahatabuddin et al., SciRep) (29,3 ° F). Naproti tomu vodní organismy jsou pod bodem mrazu vystaveny pouze −1 až –2 ° C. V extrémních zimních měsících odolává smrk smrk při teplotách blížících se -30 ° C. Aljašský brouk Upis ceramboides může přežít při teplotě -60 ° C použitím nemrznoucích prostředků, které nejsou proteiny.

Rychlost chlazení může ovlivnit hodnotu tepelné hystereze AFP. Rychlé chlazení může podstatně snížit nerovnovážný bod tuhnutí, a tím i hodnotu tepelné hystereze. V důsledku toho se organismy nemusí nutně přizpůsobit svému subzero prostředí, pokud teplota prudce klesne.

Tolerance zmrazení versus zamezení zamrznutí

Druhy obsahující AFP mohou být klasifikovány jako

Vyhýbání se mrazu : Tyto druhy jsou schopny zabránit úplnému zamrznutí jejich tělních tekutin. Obecně lze funkci AFP překonat za extrémně nízkých teplot, což vede k rychlému růstu ledu a smrti.

Mrazuvzdorný : Tyto druhy jsou schopny přežít zmrazení tělních tekutin. Předpokládá se, že některé druhy odolné vůči mrazu používají AFP jako kryoprotektanty, aby se zabránilo poškození mrazem, ale ne zmrazení úplně. Přesný mechanismus je stále neznámý. Předpokládá se však, že AFP mohou inhibovat rekrystalizaci a stabilizovat buněčné membrány, aby se zabránilo poškození ledem. Mohou pracovat ve spojení s ledovými nukleačními proteiny (INP) k řízení rychlosti šíření ledu po zmrazení.

Rozmanitost

Existuje mnoho známých nehomologických typů AFP.

Rybí AFP

Nemrznoucí glykoproteiny nebo AFGP se nacházejí v antarktických notothenioidech a tresce obecné . Mají 2,6-3,3 kD. AFGP se vyvinuly odděleně v notothenioidech a tresce severní. U notothenioidů gen AFGP vznikl z rodového genu pro serinovou proteázu podobného trypsinogenu.

• AFP typu I se vyskytuje v plísni zimní , tesaříku a tesorníku . Je to nejlépe zdokumentovaná AFP, protože jako první měla určenou svou trojrozměrnou strukturu. AFP typu I se skládá z jediné dlouhé amfipatické alfa šroubovice o velikosti přibližně 3,3 až 4,5 kD. 3D struktura má tři tváře: hydrofobní, hydrofilní a Thr-Asx.
  • AFP typu I-hyp (kde hyp znamená hyperaktivní) se nacházejí v několika flounders pravého oka. Je to přibližně 32 kD (dvě 17 kD dimerní molekuly). Protein byl izolován z krevní plazmy platýse zimního. Je podstatně lepší při depresivní teplotě mrazu než většina rybích AFP. Tato schopnost je částečně odvozena z mnoha opakování místa vázání ledu typu I.
• AFP typu II (např. P05140 ) se nacházejí u mořského havrana , tence a sledě . Jsou to globulární proteiny bohaté na cystein obsahující pět disulfidových vazeb . AFP typu II se pravděpodobně vyvinuly z lektinů závislých na vápníku (typu c). Mořští havrani, čich a sleď jsou docela odlišné linie teleostu . Pokud byl gen AFP přítomen v nejnovějším společném předkovi těchto linií, je zvláštní, že je gen rozptýlen v těchto liniích, přítomný v některých řádech a v jiných chybí. Bylo navrženo, že této nesrovnalosti lze přičíst postranní genový přenos, takže čich získal gen AFP typu II ze sledě.
• AFP typu III se nacházejí v antarktickém úhoře . Vykazují podobnou celkovou hydrofobicitu na površích vázajících led jako AFP typu I. Jejich velikost je přibližně 6 kD. AFP typu III se pravděpodobně vyvinuly z genu syntázy kyseliny sialové (SAS) přítomného v antarktickém eelpoutu. Prostřednictvím akce duplikace genu se tento gen-u kterého bylo prokázáno, že vykazuje určitou vlastní aktivitu vázající led-vyvinul ve ztrátu N-koncové části v účinný gen AFP.
• AFP typu IV ( P80961 ) se nacházejí v tesařících dlouhosrstých. Jsou to alfa šroubovicové proteiny bohaté na glutamát a glutamin. Tento protein má velikost přibližně 12 kB a skládá se ze svazku se 4 šroubovicemi. Jeho jedinou posttranslační modifikací je pyroglutamátový zbytek, cyklizovaný glutaminový zbytek na svém N-konci .

Rostlinné AFP

Klasifikace AFP se stala komplikovanější, když byly objeveny nemrznoucí proteiny z rostlin. Rostlinné AFP se dosti liší od ostatních AFP v následujících aspektech:

1. Ve srovnání s jinými AFP mají mnohem slabší aktivitu tepelné hystereze.
2. Jejich fyziologická funkce pravděpodobně spíše inhibuje rekrystalizaci ledu než brání tvorbě ledu.
3. Většina z nich jsou vyvinuté proteiny související s patogenezí , někdy si zachovávají antifungální vlastnosti.

Hmyzí AFP

Existuje řada AFP nalezených u hmyzu, včetně těch z Dendroides , Tenebrio a Rhagium brouků, smrkových budworm a bledých molů a midges (stejné pořadí jako mouchy). Hmyzí AFP sdílejí určité podobnosti, přičemž většina z nich má vyšší aktivitu (tj. Vyšší hodnotu tepelné hystereze, označovanou jako hyperaktivní) a opakující se strukturu s plochým povrchem vázajícím led. Ti z blízce příbuzných brouků Tenebrio a Dendroides jsou homologní a každé opakování 12–13 aminokyselin je stabilizováno vnitřní disulfidovou vazbou. Isoformy mají mezi 6 a 10 těchto opakování, které tvoří cívku nebo beta-solenoid. Jedna strana solenoidu má plochý povrch vázající led, který se skládá z dvojité řady threoninových zbytků. Ostatní brouci (rod Rhagium ) mají delší opakování bez vnitřních disulfidových vazeb, které tvoří stlačený beta-solenoid (beta sendvič) se čtyřmi řadami threoninového zbytku, a tento AFP je strukturálně podobný tomu modelovanému pro nehomologní AFP z bledé krásy mol. Naproti tomu AFP z můry smrku smrkového je solenoid, který se povrchově podobá proteinu Tenebrio , s podobným povrchem vázajícím led, ale má trojúhelníkový průřez s delšími opakováními, kterým chybí vnitřní disulfidové vazby. AFP z midges je strukturálně podobný těm z Tenebrio a Dendroides , ale beta-solenoid vyztužený disulfidem je vytvořen z kratších 10 opakování aminokyselin a místo threoninu povrch vázající led sestává z jedné řady tyrosinových zbytků . Springtails (Collembola) nejsou hmyz, ale jako hmyz jsou členovci se šesti nohami. Druh nalezený v Kanadě, kterému se často říká „sněhová blecha“, produkuje hyperaktivní AFP. Ačkoli se také opakují a mají plochý povrch vázající led, podobnost zde končí. Přibližně 50% zbytků tvoří glycin (Gly), s opakováním Gly-Gly-X nebo Gly-XX, kde X je jakákoli aminokyselina. Každé opakování 3-aminokyselin tvoří jedno otočení šroubovice polyprolinu typu II. Helixi se pak skládají dohromady a vytvářejí svazek, který je dva šroubovice tlusté, s lícem vážícím obličejem, jemuž dominují spíše malé hydrofobní zbytky jako alanin, než threonin. Jiný hmyz, například aljašský brouk, produkuje hyperaktivní nemrznoucí směsi, které jsou si ještě méně podobné, protože jde spíše o polymery cukrů (xylomannan) než o polymery aminokyselin (bílkoviny). Dohromady to naznačuje, že většina AFP a nemrznoucích směsí vznikla poté, co se linie, které vedly k vzniku tohoto různého hmyzu, rozcházely. Podobnosti, které sdílejí, jsou výsledkem konvergentní evoluce.

Organismy mořského ledu AFP

Mnoho mikroorganismů žijících v mořském ledu má AFP, které patří do jedné rodiny. Tyto rozsivky Fragilariopsis cylindrus a F. Curta hrají klíčovou roli v polárních mořského ledu komunity, dominuje asambláže obou vrstvy destiček a uvnitř ledových ker. AFP jsou u těchto druhů rozšířené a přítomnost AFP genů jako multigenní rodiny naznačuje důležitost této skupiny pro rod Fragilariopsis . AFP identifikované ve F. cylindrus patří do rodiny AFP, která je zastoupena v různých taxonech a lze ji nalézt v jiných organismech souvisejících s mořským ledem ( Colwellia spp., Navicula glaciei , Chaetoceros neogracile a Stephos longipes a Leucosporidium antarcticum ) a antarktických vnitrozemských ledových bakterií ( Flavobacteriaceae ), stejně jako u hub odolných vůči chladu ( Typhula ishikariensis , Lentinula edodes a Flammulina populicola ).

Bylo vyřešeno několik struktur pro AFP z mořského ledu. Tato rodina proteinů se skládá do beta šroubovice, která tvoří plochý povrch vázající led. Na rozdíl od ostatních AFP neexistuje pro místo vázající led jediný motiv sekvence.

AFP nalezeno z metagenomu z obrvený Euplotes focardii a psychrofilních bakterie má efektivní led překrystalováním inhibiční schopnosti. 1 μM Euplotes focardii consortium protein vázající led ( Efc IBP) stačí na celkovou inhibici rekrystalizace ledu při teplotě –7,4 ° C. Tato schopnost inhibice rekrystalizace ledu pomáhá bakteriím tolerovat led spíše než zabránit tvorbě ledu. Efc IBP produkuje také mezeru tepelné hystereze, ale tato schopnost není tak účinná jako schopnost inhibice rekrystalizace ledu. Efc IBP pomáhá chránit jak přečištěné proteiny, tak celé bakteriální buňky v mrazivých teplotách. Zelený fluorescenční protein je funkční po několika cyklech zmrazení a tání, když je inkubován s Efc IBP. Escherichia coli přežívá delší dobu při teplotě 0 ° C, když byl gen efcIBP vložen do genomu E. coli . EFC IBP má typickou strukturu AFP skládající se z více beta listů a alfa-šroubovice . Také všechny polární zbytky vázající led jsou na stejném místě proteinu.

Vývoj

Pozoruhodná rozmanitost a distribuce AFP naznačuje, že různé typy se vyvinuly nedávno v reakci na zalednění hladiny moře, ke kterému došlo před 1–2 miliony let na severní polokouli a před 10–30 miliony let v Antarktidě. Tento nezávislý vývoj podobných adaptací se označuje jako konvergentní evoluce . Existují dva důvody, proč mnoho typů AFP může vykonávat stejnou funkci navzdory své rozmanitosti:

1. Přestože je led rovnoměrně složen z molekul vody, má mnoho různých povrchů vystavených vazbě. Různé typy AFP mohou interagovat s různými povrchy.
2. Ačkoli se pět typů AFP liší ve své primární struktuře aminokyselin, když se každý složí do funkčního proteinu, mohou sdílet podobnosti ve své trojrozměrné nebo terciární struktuře, která usnadňuje stejné interakce s ledem.

Mechanismy účinku

Předpokládá se, že AFP inhibují růst mechanismem inhibice adsorpce - inhibice. Adsorbují se na ne bazálních rovinách ledu a inhibují termodynamicky zvýhodněný růst ledu. Přítomnost plochého, tuhého povrchu v některých AFP zdá se usnadňuje jeho interakci s ledem pomocí Van der Waalsovy síly komplementarity povrchu.

Vazba na led

Krystaly ledu pěstované v roztoku obvykle vykazují pouze bazální (0001) a hranolové plochy (1010) a vypadají jako kulaté a ploché disky. Zdá se však, že přítomnost AFP odhaluje další tváře. Nyní se zdá, že ledový povrch 2021 je preferovaným vazebným povrchem, alespoň pro AFP typu I. Při studiích na AFP typu I se původně uvažovalo o interakci ledu a AFP prostřednictvím vodíkových vazeb (Raymond a DeVries, 1977). Když však byly části proteinu, u nichž se předpokládalo, že usnadňují tuto vodíkovou vazbu, zmutovány, hypotetický pokles nemrznoucí aktivity nebyl pozorován. Nedávné údaje naznačují, že hlavním přispěvatelem by mohly být hydrofobní interakce. Je obtížné rozeznat přesný mechanismus vazby kvůli složitému rozhraní voda-led. V současné době se pokusy o odhalení přesného mechanismu provádějí pomocí programů molekulárního modelování ( molekulární dynamika nebo metoda Monte Carlo ).

Mechanismus vázání a funkce nemrznoucí směsi

Podle studie struktury a funkce nemrznoucího proteinu z Pseudopleuronectes americanus se ukázalo, že nemrznoucí mechanismus molekuly AFP typu I je způsoben vazbou na strukturu nukleace ledu způsobem podobným zipu prostřednictvím vodíkové vazby hydroxylu skupiny jeho čtyř Thr zbytků k kyslíkům ve směru v ledové mřížce, následně zastavení nebo zpomalení růstu ledových pyramidových rovin tak, aby došlo ke stlačení bodu tuhnutí. ${\ displaystyle [01 {\ overline {1}} 2]}$

Výše uvedený mechanismus lze použít k objasnění vztahu mezi strukturou a funkcí jiných nemrznoucích proteinů s následujícími dvěma společnými rysy:

1. opakování zbytku Thr (nebo jakéhokoli jiného polárního zbytku aminokyseliny, jehož postranní řetězec může tvořit vodíkovou vazbu s vodou) v období 11 aminokyselin podél příslušné sekvence a
2. vysoké procento složky zbytku Ala .

Dějiny

V 50. letech minulého století se norský vědec Scholander rozhodl vysvětlit, jak mohou arktické ryby přežít ve vodě chladnější, než je bod tuhnutí jejich krve. Jeho experimenty ho přivedly k přesvědčení, že v krvi arktických ryb je „nemrznoucí směs“. Na konci šedesátých let byl zvířecí biolog Arthur DeVries schopen izolovat nemrznoucí protein díky vyšetřování antarktických ryb. Tyto proteiny se později nazývaly nemrznoucí glykoproteiny (AFGP) nebo nemrznoucí glykopeptidy, aby se odlišily od nově objevených biologicky nemrznoucích látek (AFP) z neglykoproteinů. DeVries spolupracoval s Robertem Feeneym (1970) na charakterizaci chemických a fyzikálních vlastností nemrznoucích proteinů. V roce 1992 Griffith a kol. zdokumentovali svůj objev AFP v zimních žitných listech. Přibližně ve stejnou dobu dokumentovali Urrutia, Duman a Knight (1992) protein tepelné hystereze v krytosemenných rostlinách. Příští rok Duman a Olsen poznamenali, že AFP byly také objeveny u více než 23 druhů krytosemenných rostlin , včetně těch, které jedli lidé. Hlášili také jejich přítomnost v houbách a bakteriích.

Změna jména

Byly provedeny nedávné pokusy znovu označit nemrznoucí proteiny jako proteiny strukturující led, aby přesněji reprezentovaly jejich funkci a zbavily se jakéhokoli předpokládaného negativního vztahu mezi AFP a automobilovou nemrznoucí směsí, ethylenglykolem . Tyto dvě věci jsou zcela oddělené entity a vykazují volnou podobnost pouze ve své funkci.

Komerční a lékařské aplikace

Četná pole by mohla těžit z ochrany poškození tkáně zmrazením. Podniky v současné době zkoumají použití těchto proteinů v:

• Zvýšení odolnosti plodin vůči mrazu a prodloužení sklizně v chladnějších klimatech
• Zlepšení produkce farmových ryb v chladnějších klimatech
• Prodloužení trvanlivosti mražených potravin
• Zlepšení kryochirurgie
• Zlepšení zachování tkání pro transplantaci nebo transfuzi v medicíně
• Terapie pro podchlazení
• Lidská kryokonzervace (kryonika)

Společnost Unilever získala souhlas Velké Británie, USA, EU, Mexika, Číny, Filipín, Austrálie a Nového Zélandu k používání geneticky modifikovaných kvasinek k výrobě nemrznoucích proteinů z ryb pro použití při výrobě zmrzliny. Na etiketě jsou označeny jako „ISP“ nebo protein strukturující led, místo AFP nebo nemrznoucího proteinu.

Nedávné novinky

Jedním z posledních úspěšných obchodních snah bylo zavedení AFP do zmrzlinových a jogurtových produktů. Tato složka, označená jako protein strukturující led, byla schválena Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv . Proteiny jsou izolovány z ryb a replikovány ve větším měřítku v geneticky modifikovaných kvasinkách.

Organizace, které jsou proti geneticky modifikovaným organizmům (GMO), se domnívají, že nemrznoucí proteiny mohou způsobit zánět. Příjem AFP ve stravě je pravděpodobně ve většině severních a mírných oblastí pravděpodobně značný. Vzhledem ke známé historické spotřebě AFP lze bezpečně učinit závěr, že jejich funkční vlastnosti nezpůsobují u lidí žádné toxikologické ani alergenní účinky.

Také transgenní proces produkce ISP je ve společnosti již široce používán. Pomocí této technologie se vyrábí inzulín a syřidlo . Tento proces nemá vliv na produkt; pouze zefektivňuje produkci a brání úhynu ryb, které by jinak byly zabity k extrakci bílkovin.

V současné době Unilever začleňuje AFP do některých svých amerických produktů, včetně některých Popsicle ice pops a nové řady zmrzlinových tyčinek Breyers Light Double Churned. V zmrzlinách umožňují AFP výrobu velmi krémové, husté zmrzliny se sníženým obsahem tuku s menším počtem přísad. Řídí růst ledových krystalů způsobený rozmrazováním na nakládacím doku nebo kuchyňském stole, což snižuje kvalitu textury.

V listopadu 2009 sborník Národní akademie věd publikoval objev molekuly u aljašského brouka, která se chová jako AFP, ale je složena ze sacharidů a mastných kyselin .

Studie z roku 2010 prokázala stabilitu přehřátých krystalů vodního ledu v roztoku AFP a ukázala, že zatímco proteiny mohou inhibovat zmrazení, mohou také inhibovat tání.

V roce 2021 vědci EPFL a Warwick našli umělou imitaci nemrznoucích proteinů.

Reference

Další čtení

externí odkazy

• Studený, tvrdý fakt: Rybí nemrznoucí směs vyráběná ve slinivce
• Nemrznoucí proteiny: Molekula měsíce , David Goodsell, RCSB Protein Data Bank
• Přehled všech strukturálních informací dostupných v PDB pro UniProt : Q9GTP0 (tepelná hystereze nebo nemrznoucí protein) na PDBe-KB .